日本血吸虫雌虫抗原模拟表位的筛选及免疫保护性

目的　筛选日本血吸虫雌虫抗原的模拟表位 ,并探讨其抗日本血吸虫的免疫保护效果。　方法　用日本血吸虫雌虫免疫兔血清IgG作配体对噬菌体随机 12肽库进行 3轮亲和筛选 ,随机挑取 18个噬菌体克隆用Dot ELISA检测其特异性 ,并对其中的 4个阳性克隆进行测序。分别在 0、2、4周用混合噬菌体克隆免疫小鼠 3次 ,第 6周每鼠经腹部感染 40条日本血吸虫尾蚴 ,42d后剖杀冲虫 ,计数虫数和每克肝卵数。　结果　经 3轮筛选 ,特异性噬菌体富集了 2 0 0多倍 ,随机挑取的 18个克隆经Dot ELISA鉴定有 17个能与雌虫抗原免疫兔血清呈阳性反应。DNA自动测序的 4个序列与GenBank的已知序列均无同源性。与对照组相比 ,混合噬菌体克隆免疫小鼠的减虫率为 2 6.5 7% ,减卵率为 65 .3 4%。　结论　采用噬菌体随机肽库技术可获得模拟日本血吸虫雌虫特异性抗原表位的短肽分子 ,这些短肽分子能诱导一定程度的保护性免疫。     

蒿甲醚预防日本血吸虫病诱导的兔特异抗体相关靶抗原编码基因的筛选

目的寻找应用蒿甲醚预防血吸虫后,引起免疫保护作用的抗原分子,为血吸虫病疫苗研究提供新的候选抗原。方法感染血吸虫7天后的家免口服蒿甲醚,收集血清,用蒿甲醚预防后的免疫免血清筛选日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)成虫 cDNA 文库,并对阳性克隆的插入基因片段进行 PCR 扩增及测序分析。结果经三轮筛选,获8个阳性克隆。测序分折所获的这8个序列,其中5个序列分别与日本血吸虫三磷酸甘油醛脱氢酶基因(Sj GAPDH)基因同源,其余3个序列为日本血吸虫28kD 谷胱甘肽-S-转移酶(Sj.GST)基因。结论 Sj.GAPDH 和 Sj.28kDGST 可能是蒿甲醚杀伤血吸虫后,引起对再感染起免疫保护作用的抗原分子。     

IMMUNOSCREENING OF SCHISTOSOMA JAPONICUM EGG cDNA LIBRARY

目的：从日本血吸虫虫卵文库中筛选并鉴定出与免疫诊断及免疫预防有关的基因克隆。方法：采用Ｓ．ｊＳＥＡ超免疫兔血清对日本血吸虫卵文库进行筛选。先去除抗大肠杆菌抗体，经三轮筛选得到１２个阳性克隆，然后，用辅助噬菌体进行体内剪切，经抗菌素平板筛选含重组质粒的阳性菌落，每个菌落分为２份，一份进行ＰＣＲ扩增以测定插入片段的大小。另一份用于制备纯质粒ＤＮＡ模板，进行ＤＮＡ序列测定，通过ＧＣＧ软件对所得ＤＮＡ序列与ＧｅｎＢａｎｋ中的序列进行同源性比较。结果：共筛得１２个阳性克隆，ＰＣＲ后测得其长度大多为１．２ｋｂ，其中８个与Ｓ．ｊ热休克蛋白７０的基因同源，２个与Ｓ．ｊ钙网蛋白同源，１个与Ｓ．ｍｉｍｍｕｎｏｐｈｉｌｉｎ同源，１个与Ｓ．ｊ２３ｋＤａ蛋白同源。结论：本研究首次报道用抗ＳＥＡ血清对日本血吸虫虫卵文库的筛选结果，所得的１２个阳性克隆均为编码日本血吸虫免疫诊断及预防有关的基因。     

紫外线致弱尾蚴免疫兔血清筛选日本血吸虫童虫cDNA文库

目的筛选紫外线致弱尾蚴中起免疫保护作用的抗原分子,分析其主要表位,为血吸虫病疫苗研究提供新的候选抗原。方法以紫外线照射致弱尾蚴免疫兔血清筛选日本血吸虫童虫cDNA文库,对阳性克隆插入片段的核苷酸进行序列分析,并利用软件Antheprot对所筛基因编码的抗原分子进行表位预测。结果经三轮筛选,共获20个阳性克隆,序列同源性分析表明其中有5种已知基因(GST、副肌球蛋白、肌球蛋白、钙离子激活蛋白和3-磷酸甘油醛脱氢酶),6种未知基因,软件分析显示不同抗原分子分别具有多个不同的抗原表位。结论获得的阳性克隆插入基因片段可能为潜在的日本血吸虫病疫苗分子,可能是多抗原、多表位在照射致弱尾蚴中起免疫保护作用。     

日本血吸虫雄虫免疫血清对成虫cDNA文库的筛选及克隆分析

目的　筛选和分析日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,Sj)新基因 ,为血吸虫疫苗研究提供新的候选分子。 方法　以日本血吸虫雄性成虫抗原免疫兔血清为探针 ,筛选Sj成虫cDNA文库 ,对阳性克隆的插入片段进行PCR鉴定及测序分析。通过互联网对测序获得的核苷酸序列进行同源性分析 ,并预测新基因编码蛋白的结构与功能。结果　筛选获 11个阳性克隆 ,其插入SjcDNA片段大小在 0 7～ 2 3kb之间。对部分阳性克隆进行测序分析 ,获两个Sj新基因 ,即Sj-MA及Sj -Cp8(登录号分别为AF5 1980 8和AF5 2 4 896 ) ,分别编码 2 4 9和 71个氨基酸的核内蛋白和胞浆蛋白。Sj-MA蛋白含有 9个蛋白激酶C磷酸化位点、3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、2个酪氨酸激酶磷酸化位点和 1个N -肉豆蔻酸化位点。Sj-Cp8蛋白含一个跨膜区、3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、2个N -肉豆蔻酸化位点。结论　筛选Sj成虫cDNA文库所获得两个新基因 ,其编码的蛋白可能为存在于胞浆和胞核内的日本血吸虫的重要信息传递分子 ,有望成为新的血吸虫病疫苗候选分子。     

大鼠感染血清免疫筛选弓形虫速殖子cDNA文库

目的为弓形虫病疫苗的研制提供新的抗原分子。方法用弓形虫RH株速殖子感染大鼠,分离其血清作为探针筛选弓形虫cDNA文库,对阳性克隆的插入片段分别进行PCR扩增及DNA序列测定。结果从cDNA文库4×105~5个噬菌斑中筛选出13个阳性克隆,其插入片段大小分别为0.45～2.4kb。对L1、L2、L4和L5四个克隆进行测序,将所得序列查询基因库,结果,克隆L2与弓形虫P24主要抗原基因序列相同,L4与蔗糖丙酮酸磷酸激酶具有同源性,L1无任何相匹配的序列,为未曾报告过的新基因(GenBank登录号为AY180109),命名为T.g-R1。T.g-R1编码134个氨基酸的非跨膜蛋白。PROSCAN分析显示T.g-R1含有2个蛋白激酶C磷酸化位点,2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,1个肉豆酸酰化位点,1个微体细胞C端靶信号。L5为一小片段,无完整编码读框。结论阳性克隆的筛选和鉴定为抗弓形虫病疫苗的研制提供又一途径。     

日本血吸虫雌虫抗原免疫血清筛选成虫cDNA文库

目的筛选日本血吸虫(Schistosoma ja ponicum，Sj)新的疫苗候选基因或雌虫性别特异性基因。方法用Sj雌虫抗原免疫家兔制备血清，对Sj成虫cDNA文库进行免疫筛选，将阳性克隆的插入片段进行PCR扩增，采用Sanger双脱氧核苷酸末端终止法对阳性克隆插入子进行测序，与GeneBank中的已知序列进行比对分析。结果共获得26个阳性克隆，其PCR产物大小约0．5～3kb。在进行测序的8个阳性克隆中发现了GeneBank未报道的Sj肌球蛋白的部分基因序列(GeneBank登录号为AY322148)和1个新基因(命名为Sj-F1，GeneBank登录号为AY261995)。Sj-F1编码的蛋白理论分子质量为13．45ku，等电点为6．29，富含α螺旋和随机卷曲，含多个蛋白激酶磷酸化位点，1个酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位点和1个豆蔻酸位点。结论Sj雌虫免疫血清可识别Sj特异性抗原分子，该抗原基因是否为雌虫性别特异性基因及其作为日本血吸虫病疫苗候选基因的价值，有待进一步研究。     

用噬菌体多肽库筛选日本血吸虫表膜抗原的模拟表位

为探索可用于诊断的模拟表膜抗原。采用纯化的兔抗表膜抗原IgG作探针 ,免疫筛选噬菌体随机十二肽库 ,经 3轮生物淘洗后 ,随机挑选 30个噬菌体克隆 ,用ELISA检测其与筛选抗体的特异性结合 ,选择两个阳性克隆进行DNA序列测定 ,并用斑点ELISA比较检测正常人和日本血吸虫病患者血清各 10份。结果显示 ,随机挑选的 30个克隆中有 9个噬菌体克隆与筛选的抗体有特异性的结合反应。DNA测序结果显示 ,两个阳性噬菌体克隆 (携带的抗原表位 )所演绎的氨基酸序列与GenBank已知的氨基酸序列无同源性。斑点ELISA结果显示两个抗原表位可被血吸虫病患者血清呈特异性识别     

一种鉴别免疫筛选噬菌体克隆真、假阳性的方法

目的探讨及早鉴别用免疫学方法筛选cDNA文库得到的阳性克隆是否真实可靠的方法.方法将阳性噬菌体克隆与宿主菌按一定的比例诱导培养后,取沉淀做SDS-PAGE后行W estern b lot;同时取出一个阳性克隆进行亚克隆,直至3次亚克隆均为全部阳性.结果3次亚克隆均为全部阳性的噬菌体克隆,在W estern b lot鉴定中也呈阳性反应.结论可用W estern b lot方法来鉴别用免疫学方法筛选cDNA文库得到的阳性克隆是否真实可靠.