丹参植株原位侵染RNAi毛状根体系的建立及其干扰效果

目的:利用土培植物进行原位侵染获得RNAi型丹参毛状根,并对其干扰效果进行研究。方法:利用转化有目标基因RNAi载体的发根农杆菌对土壤中生长的丹参幼苗根茎部分进行侵染产生毛状根,经荧光显微镜鉴定阳性毛状根,并利用实时荧光定量PCR检测目标基因的表达情况。结果:在土培丹参根茎部分成功侵染产生毛状根,利用荧光显微镜进行检测显示目标基因RNAi型毛状根阳性转化率为72.72%,RNAi空载毛状根阳性转化率为66.67%。实时荧光定量PCR结果表明RNAi型毛状根中目标基因表达受到抑制,表达量下降到空载型对照组的8.61%,证明对土培植物直接进行侵染能够成功诱导RNAi毛状根。结论:采用原位侵染法诱导丹参根茎部位成功产生阳性RNAi型毛状根,侵染过程无需无菌操作,简单快捷,对植株生长无影响,能够用于功能基因的体内功能研究。     

丹参酮生物合成途径中C20位氧化酶改造研究

丹参酮类化合物是丹参主要有效成分之一，在心血管类疾病治疗中发挥重要作用，丹参酮类化合物的微生物异源生产能够为含丹参中药制剂生产提供大量原材料，降低提取成本，缓解临床用药压力。丹参酮生物合成途径包含多个P450酶，高效优势的催化元件是丹参酮微生物生产的基础，该研究以丹参酮途径关键P450-C20位羟化酶CYP76AK1为研究对象，使用SWISS-MODEL、Robetta和AlphaFold2这3种蛋白建模方法，对所得蛋白模型进行分析，获取可靠蛋白结构，以分子对接和同源比对进行突变体蛋白的半理性设计。筛选发现了影响CYP76AK1氧化活性的关键氨基酸位点，通过真核表达对所得突变体进行体外功能研究。研究获得了对11-羟基柳杉酚具有连续氧化功能的CYP76AK1突变体元件，解析了影响其氧化活性的4个关键氨基酸位点，并根据突变结果分析3种蛋白建模方法的可靠性。研究首次报道了丹参中CYP76AK1的有效蛋白改造位点，为丹参酮类化合物合成生物学研究提供了C20位不同氧化活性的催化元件，为解析C20位修饰P450蛋白的连续氧化机制奠定基础。