血必净注射液对多种病毒的抑制作用及机制研究

目的 在细胞水平评价血必净注射液（简称血必净）对水疱性口炎病毒（VSV）、甲型流感病毒（H1N1）、Ⅰ型单纯疱疹病毒（HSV-1）等多种病毒复制的影响,并探讨其与免疫系统相关的作用机制。方法 通过CCK-8法检测血必净对A549细胞活力的影响;采用流式细胞术及实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测血必净对VSV-eGFP、H1N1、HSV-1复制的影响;利用碘化丙啶（PI）染色检测血必净对病毒引起的细胞死亡的影响;qRT-PCR检测血必净对干扰素（IFN）及干扰素刺激基因（ISGs）mRNA水平的影响,以及其对病毒引起的促炎细胞因子基因表达的影响。结果 血必净以剂量相关方式抑制VSV、H1N1及HSV-1等病毒的复制（P＜0.001）,并显著减少病毒诱发的细胞死亡（P＜0.05）;血必净能有效降低病毒感染诱导的IL1Β、IL6、TNFΑ基因的表达（P＜0.05）,并抑制IFIT1、IFIT2等ISGs的表达（P＜0.05）。结论 血必净能在体外抑制多种病毒的复制,降低病毒诱导的细胞死亡和炎症反应,其抗病毒的机制可能独立于Ⅰ型IFN信号通路。     

异土木香内酯体外抗病毒作用与机制研究

目的 研究异土木香内酯的体外抗病毒作用及机制。方法 CCK-8法检测0.125、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000、16.000、32.000、64.000 μmol·L^-1的异土木香内酯处理24 h对人非小细胞肺癌细胞系（A549）细胞活力的影响;表达绿色荧光蛋白的水疱性口炎病毒（VSV-eGFP）以0.02的感染复数（MOI）感染A549细胞制备模型,流式细胞术检测共同孵育12 h的异土木香内酯5、10、20 μmol·L^-1对GFP阳性细胞率的影响;VSV感染（MOI=0.1） A549细胞,Western blotting检测异土木香内酯处理16 h对VSV病毒G蛋白表达的影响;分别使用甲型流感病毒（H1N1,MOI=0.1）、脑心肌炎病毒（EMCV,MOI=0.1）感染A549细胞,同时给药共同孵育8 h后,实时荧光定量PCR （qRT-PCR）检测土木香内酯对病毒RNA表达的影响;异土木香内酯分别以预处理12 h、病毒吸附过程中给药2 h、病毒吸附后给药10 h 3种不同方式给药,通过流式细胞术检测其对VSV-eGFP在A549细胞中复制的影响;异土木香内酯20 μmol·L^-1处理胚胎成纤维（MEF）细胞12 h,进行转录组测序分析;异土木香内酯5、10、20 μmol·L^-1处理MEF细胞12 h,qRT-PCR检测干扰素α1（Ifna1）、干扰素β1（Ifnb1）、干扰素诱导蛋白44（Ifi44）、干扰素刺激基因15（Isg15）的mRNA表达。结果 异土木香内酯对A549细胞的半数抑制浓度（IC₅₀）为51.01 μmol·L^-1;与模型组比较,流式结果显示异土木香内酯显著减少VSV-eGFP阳性细胞率（P<0.001）,但对病毒的吸附过程没有影响,药物预处理及吸附后给药显著抑制VSV病毒复制（P<0.01、0.001）;qRT-PCR结果显示异土木香内酯显著降低H1N1、EMCV病毒的mRNA水平（P<0.001）;Western blotting结果显示异土木香内酯显著抑制VSV的G蛋白表达（P<0.001）;转录组测序分析和qRT-PCR结果表明,异土木香内酯促进I型干扰素通路的激活,并诱导Ifna1、Ifnb1、Ifi44、Isg15（P<0.001）表达。结论 异土木香内酯通过促进基于干扰素通路的抗病毒天然免疫激活,发挥抑制病毒复制的作用。     

防己诺林碱阻断自噬抑制 H1N1病毒感染的研究

目的 探索防己诺林碱在细胞水平抗H1N1病毒的作用,阐明防己诺林碱调控细胞自噬抑制H1N1病毒复制的分子机制。方法 CCK-8法检测0.312 5、0.625 0、1.250 0、2.500 0、5.000 0、10.000 0、20.000 0、40.000 0、60.000 0 μmol·L^-1的防己诺林碱对MDCK细胞活力的影响;MDCK细胞设置对照组、模型组和防己诺林碱（2.5、5.0、10.0 μmol·L^-1）组,除对照组外,以感染复数（MOI）为0.1的H1N1病毒感染MDCK细胞,加入防己诺林碱共同孵育12 h,同时设置防己诺林碱（10.0 μmol·L^-1）与病毒共同孵育4、8 h组,通过实时荧光定量PCR （qRT-PCR,检测HIN1 mRNA表达）和Western blotting ［H1N1病毒核蛋白（NP）］检测防己诺林碱对病毒复制的抑制作用;PI/Hoechst 33342染色检测防己诺林碱（10.0 μmol·L^-1）对MDCK细胞死亡的影响;qRT-PCR法检测防己诺林碱检测防己诺林碱预处理、病毒感染早期药物处理、病毒感染晚期药物处理以及吸附和进入阶段给药对病毒复制的影响;MDCK细胞转染EGFP-LC3或EGFP-mCherry-LC3双荧光质粒,观察防己诺林碱对EGFP-LC3的荧光强度、EGFP-mCherry-LC3共定位的影响,设置自噬诱导剂雷帕霉素（0.5 μmol·L^-1）、自噬晚期抑制剂氯喹（10 μmol·L^-1）、巴佛洛霉素A1 （100 nmol·L^-1）对照。转染过EGFP-LC3质粒的MDCK细胞感染H1N1病毒,免疫荧光检测防己诺林碱对LC3与胞内的病毒NP蛋白共定位的影响;体外培养A549细胞,以MOI为0.1的H1N1病毒感染,Western blotting检测防己诺林碱对LC3II/LC3I蛋白表达的影响。结果 防己诺林碱对MDCK细胞的半数抑制浓度（IC₅₀）为40.19 μmol·L^-1 ;与模型组比较,防己诺林碱以浓度相关性的方式抑制HIN1 mRNA表达,以浓度和时间相关性的方式抑制NP蛋白表达（P＜0.01、0.001）;显著减少H1N1诱导的细胞死亡（P＜0.001）;抑制H1N1病毒进入过程。与对照组比较,防己诺林碱处理诱导LC3荧光聚集,诱导EGFP-LC3和mCherry-LC3双荧光共定位显著增加（P＜0.001）。与模型组比较,防己诺林碱处理明显减少NP的荧光数量（P＜0.001）,同时造成LC3荧光积累并与胞内的病毒NP蛋白共定位;引起LC3II积累（P＜0.01、0.001）。结论 防己诺林碱同氯喹和巴佛洛霉素A1一致,阻断自噬途径,使病毒粒子在自噬体内滞留,破坏病毒生命周期。