小鼠β-防御素2肿瘤疫苗的抗白血病作用研究

目的：探讨小鼠β-防御素2（MBD2）肿瘤疫苗的体内抗白血病作用及其机制。方法：小鼠体内接种转染MBD2的L1210小鼠白血病细胞（L1210-MBD2），观察细胞的致瘤性改变；对长期存活的小鼠用野生型L1210细胞进行二次攻击，探讨瘤苗的免疫保护作用；用照射L1210-MBD2瘤苗注射荷瘤小鼠，检测瘤苗的治疗效果。采用乳酸脱氢酶活性法测定接种瘤苗后小鼠脾脏细胞CTL及NK细胞毒活性，ELISA法检测脾细胞产生IFN-γ及IL-12含量。结果：转染MBD2使L1210细胞致瘤性明显降低（P〈0．05），80％小鼠长期生存；对照组小鼠全部死亡。用野生型L1210细胞二次攻击后100％dx鼠仍能长期生存。照射瘤苗能使50％的荷瘤小鼠长期生存，而对照组小鼠则全部死亡，两者之间具有显著性差异（P〈0．05）。接种MBD2瘤苗后，小鼠脾细胞对L1210的CTL及NK杀伤活性明显增强（P〈0．05），产生IFN-γ、IL-12水平显著升高（P〈0．05）。结论：L1210-MBD2瘤苗通过调节机体细胞免疫反应显示出较强的体内抗白血病作用，为淋巴细胞性白血病的免疫治疗提供了新策略。     

M-CSF targeting into LCL nucleus behaves as a malignancy promotor

Objective: To investigate the functions of nM-CSF in malignant cells. Methods: recombinant M-CSF was targeted into cell nucleus by employing a eukaryotic expression plasmid vector pCMV/myc/nuc. The constructed plasmid was transfected into cells of EBV transformed lymphoblastoid cell line (LCL). RT-PCR, Western blot and immunofluorescent staining showed that recombinant M-CSF was localized into LCL cell nucleus. The transgenic cells showed elevated proliferation potential, enhanced resistance to apoptosis and increased ability of in vitro migration. Conclusion: Nucleus presenting M-CSF might act as a promoting factor in the processes of cellmalignancy.     

mda-7/IL-24和IL-24 delE5诱导急性髓系白血病细胞向单核细胞分化

目的:研究人黑素瘤分化相关基因-7(melanoma differentiation associated gene-7,mda-7;又称IL-24)及其剪接体IL-24 delE5与急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)细胞分化的关系。方法:十四烷酰佛波醇-乙酯(12-O-tetrade-canoylphorbol-13-acetate,TPA)处理人急性髓系白血病细胞系U937、HL-60,real-time PCR及Western blotting检测细胞中mda-7/IL-24和IL-24 delE5的表达,FACS检测细胞表面CD11b、CD14和CD115的表达。siRNA干扰U937、HL-60细胞中mda-7/IL-24和IL-24 delE5的表达后,再以TPA诱导细胞分化,FACS检测CD11b、CD14和CD115的表达。用前期构建的mda-7/IL-24和IL-24 delE5载体转染U937、HL-60及AML-M5患者的原代白血病细胞,观察异位过表达mda-7/IL-24和IL-24 delE5能否诱导白血病细胞向单核细胞分化。结果:TPA在诱导U937、HL-60细胞向单核细胞分化过程中显著促进mda-7/IL-24及其剪接体IL-24 delE5的表达,用siRNA干扰mda-7/IL-24及IL-24 delE5的表达后,TPA诱导U937、HL-60细胞向单核细胞分化的作用也被阻断。异位过表达mda-7/IL-24和IL-24 delE5可诱导U937、HL-60以及原代AML细胞向单核细胞分化:U937、HL-60细胞表面CD11b和CD14表达均显著升高,CD115表达仅在U937细胞有显著升高;3例AML-M5患者的原代AML细胞中CD11b、CD14及CD115表达均有不同程度升高,细胞呈现单核细胞的形态特征。结论:TPA可通过上调mda-7/IL-24及其剪接体IL-24 delE5的表达诱导白血病细胞向单核细胞分化。     

小鼠β-防御素2肿瘤疫苗的构建及特性鉴定

目的：构建分泌性小鼠β-防御素2（MBD2）真核表达质粒,转染L1210淋巴细胞白血病细胞,对转染细胞进行功能及特性鉴定。方法：RT-PCR法从小鼠皮肤细胞克隆MBD2成熟部分基因片段,用overlap PCR法将小鼠Igκ信号肽与MBD2成熟片段相连,构建MBD2分泌表达载体。经测序证实序列正确后,脂质体法转染L1210细胞,筛选稳定表达细胞株。RT-PCR、Western blot检测瘤苗MBD2的表达。Transwell法检测瘤苗分泌的MBD2对不成熟树突状细胞（iDC）迁移的作用。细胞计数、PI染色及FACS观察转染MBD2对肿瘤细胞增殖、细胞周期及MHCⅠ类（H-2K^d,H-2D^d）、Ⅱ类（I-A^d）分子及共刺激分子（CD80、CD860）表达的影响。结果：转染MBD2基因的肿瘤细胞表达并分泌MBD2,并以剂量依赖方式趋化iDC,表明具有生物学活性。转染MBD2基因对肿瘤细胞生长增殖、细胞周期及细胞表面MHC分子及共刺激分子表达无明显影响。结论：本实验成功构建了MBD2白血病细胞疫苗,为进一步体内评价抗白血病效果奠定了基础。     

膜结合型巨噬细胞集落刺激因子对巨噬细胞功能性极化影响的探索

 目的　探讨高表达膜结合型巨噬细胞集落刺激因子（mM-CSF）的血液肿瘤细胞对巨噬细胞的异常活化作用。方法　采用稳定表达mM-CSF的淋巴瘤细胞系Namalwa-M和巨噬细胞系RAW264.7体外共培养体系,以转入空载体的Namalwa-V细胞系共培养体系为对照组。流式细胞术检测RAW264.7的CD206（选择性活化巨噬细胞高表达的表面分子）和细胞内白细胞介素（IL）-6、IL-10、IL-12及TNF-α的表达水平;墨汁吞噬实验检测共培养RAW264.7细胞的功能变化。 结果　与Namalwa-M共培养的RAW264.7 的CD206表达水平明显升高平均均荧光强度为55.12±3.77,提示其巨噬细胞活性增强;IL-10、TNF-α表达上调（201±6）%、（136±6）%;IL-12、IL-6表达下调（990±528）%、（60±26）%;吞噬能力明显提高。结论　高表达mM-CSF的血液肿瘤细胞可异常活化巨噬细胞成为高表达IL-10、TNF-α,低表达IL-12、IL-6的异常活化巨噬细胞。     

白细胞介素-24 delE5对人类白血病细胞系K562的抑制作用

 目的　探索白细胞介素（IL）-24 delE5对人类白血病细胞系K562的抑制作用。方法　用TPA诱导白血病细胞系U937和HL-60向单核-巨噬细胞分化后,检测mda-7／IL-24及其选择性剪接体IL-24 delE5的表达。构建IL-24 delE5真核表达载体,稳定转染K562细胞。通过MTT法、集落形成实验、流式细胞术、Annexin-Ⅴ／PI检测及动物实验,观察IL-24 delE5对K562细胞增殖、集落形成、细胞周期、凋亡及体内致瘤性的影响;同时与mda-7／IL-24进行比较。结果　在TPA诱导分化的U937和HL-60细胞中发现IL-24 delE5的表达。稳定转染IL-24 delE5的K562增殖及集落形成明显下降,与空载体相比,G0／G1期细胞比例由（24.46±3.99）%增至（42.69±3.04）%,细胞周期阻滞于G0／G1期,体内实验证实K562细胞移植瘤生长明显被抑制。与mda-7／IL-24相比,上述各实验结果差异均无统计学意义。结论　IL-24 delE5与mda-7／IL-24一样对人类白血病细胞系K562具有明显的体内外抑制作用,该作用可能与IL-24 delE5所引起细胞周期G0／G1期阻滞有关。     

不同制剂诱导单个核细胞IL-23、IL-12亚基表达的对比分析

为探索并比较人类外周血单个核细胞(PBMC)IL-23、IL-12亚基表达的诱导剂和调控模式,分离正常人PBMC、单核细胞、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群,检测各种细菌、细菌产物、细胞因子、丝裂原对上述细胞IL-23和IL-12亚基表达的诱导作用,半定量RT-PCR方法测定各亚基的mRNA表达水平。结果显示,未经刺激的PBMC可表达IL-23p19和IL-12p35mRNA;脂多糖(LPS)和金黄色葡萄球菌(SAC)可上调PBMCIL-23和IL-12各亚基的表达;γ干扰素(IFN-γ)预处理后予LPS刺激可使单核细胞IL-23p19、IL-12p35和IL-12p40表达高于LPS直接作用的表达水平。植物血凝素(PHA)可促进CD4+、CD8+T细胞IL-23p19表达,而对IL-12p35、p40表达无调节作用。本文结果提示,IL-23的两个亚基的表达都处于紧密调控之下,易受各类诱导剂调节;人类外周血细胞IL-23p19的表达和调控模式与IL-12p35既有相似之处又存在不同点。     

miR-146a在HepG2.2.15细胞中对c-Myc基因表达影响的研究

目的 构建has-miR-146a真核过表达载体pmR-146a,探究其在HepG2.2.15肝癌细胞中对c-Myc基因的表达调控作用.方法 PCR扩增has-miR-146a的前体基因片段(pre-has-miR-146a),双酶切后连接到pmR-mCherry载体上,通过菌落PCR、双酶切和测序验证重组载体的准确性;将重组载体转染到HepG2.2.15肝癌细胞中作为实验组,同时设空载体组(转染pmR-mCherry空质粒组),空白组(转染试剂Lipofectamin0 2000+ PBS),24、48 h后观察载体荧光蛋白表达量,qPCR检测各组细胞has-miR-146a表达情况;转染24、48 h后qPCR检测c-Myc基因mRNA表达量,48 h后Western blot检测c-Myc蛋白表达水平.结果 经菌落PCR、双酶切和测序证实,pre-has-miR-146a基因片段插入pmR-mCherry载体中;实验组和空载体组转染24、48 h荧光显微镜观察可见强荧光,与非荧光条件下作对比,转染效率在50％～60％;实验组has-miR-146a表达量明显高于空载体组和空白组(P＜0.01);转染24、48 h后实验组细胞c-Myc基因mRNA表达量较空载体组和空白组低(P＜0.05);转染48 h后,蛋白表达量较空载体组和空白组低(P＜0.01).结论成功构建has-miR-146a真核过表达载体pmR-has-146a,该重组载体可稳定表达has-miR-146a;has-miR-146a可以下调c-Myc癌基因的表达,可以作为治疗原发性肝癌的潜在靶点之一.     

mda7-/IL2-4和IL2-4delE5诱导急性髓系白血病细胞向单核细胞分化

目的:研究人黑素瘤分化相关基因-7(melanoma differentiation associated gene-7,mda-7;又称IL-24)及其剪接体IL-24 delE5与急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)细胞分化的关系。方法:十四烷酰佛波醇-乙酯(12-O-tetrade-canoylphorbol-13-acetate,TPA)处理人急性髓系白血病细胞系U937、HL-60,real-time PCR及Western blotting检测细胞中mda-7/IL-24和IL-24 delE5的表达,FACS检测细胞表面CD11b、CD14和CD115的表达。siRNA干扰U937、HL-60细胞中mda-7/IL-24和IL-24 delE5的表达后,再以TPA诱导细胞分化,FACS检测CD11b、CD14和CD115的表达。用前期构建的mda-7/IL-24和IL-24 delE5载体转染U937、HL-60及AML-M5患者的原代白血病细胞,观察异位过表达mda-7/IL-24和IL-24 delE5能否诱导白血病细胞向单核细胞分化。结果:TPA在诱导U9...     

人mda-7/IL-24对慢性粒细胞白血病K562细胞的抑制作用

摘 要 目的: 探索人黑素瘤分化相关基因-7（melanoma differentiation associated gene7，mda7；又称IL-24）对慢性粒细胞白血病K562细胞的抑制作用。方法：用RTPCR法检测11个造血系统恶性肿瘤细胞系mda-7受体的转录情况。用脂质体转染法将构建的重组真核表达载体pTargetIL24转染K562细胞。以RTPCR和Western blotting方法检测转染的K562细胞mda7的表达情况；通过MTT法、集落形成实验、流式细胞术、AnnexinⅤ/PI检测mda7/IL24对K562细胞增殖、集落形成、细胞周期和凋亡的影响；以裸鼠移植瘤模型观察mda-7对K562细胞移植瘤的治疗作用。结果：在11个造血系统恶性肿瘤细胞系（NB4、HL60、CEM、Namalwa、Jurkat、KG1a、U937、K562、Ramos、J61、HEL细胞）中没有检测到完整mda7受体的表达。转染mda7的K562细胞能显著表达mda-7mRNA及其蛋白；其与转染空载体和未转染的K562细胞相比，细胞增殖活力以及集落形成能力明显下降（P＜0.05），细胞周期阻滞于G0/G1期（P＜0.05），但细胞凋亡率没有明显变化。裸鼠体内实验证实了mda7/IL24明显抑制K562细胞移植瘤生长（P＜0.01）。结论：mda-7/IL-24对白血病细胞系K562具有明显的体内外抑制作用，该作用与mda7/IL24引起细胞周期G0/G1期阻滞有关。