应用AdEasy腺病毒载体系统构建鼠白细胞介素10基因重组腺病毒

目的:AdEasy系统可在原核细胞E.coli BJ5183中完成穿梭质粒与骨架质粒之间的高效同源重组,经抗生素培养板筛选重组体,然后转染293细胞获得重组病毒,极大简化了载体的构建过程.实验利用AdEasy腺病毒载体系统构建鼠白细胞介素10基因重组腺病毒.方法:实验于2006-08/2007-05在青岛大学医学院病毒学实验室完成.①实验材料:清洁级SD大鼠5只,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,骨架质粒pAdeasy-1,大肠杆菌BJ5183和DH10B,人胚肾293细胞均由青岛大学医学院微生物教研室罗兵教授惠赠.②实验方法:从脂多糖刺激培养的大鼠脾细胞中提取细胞总RNA,应用反转录多聚酶链反应技术扩增白细胞介素10 cDNA,定向亚克隆至pAdtrack-CMV中构建腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV-IL-10,酶切线性化后转化到含腺病毒骨架质粒pAdEasy的BJ5183大肠杆菌中,获得重组腺病毒质粒pAd-IL-10,Lipofectamin包装转染293细胞,获得重组腺病毒vAd-IL-10,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达.将293细胞接种于96孔板中,每孔1×104个细胞,浓缩后的病毒贮存液按不同比例稀释加至培养板中,测定重组腺病毒滴度.用重组腺病毒vAd-IL-10感染293细胞3 d后,以TRIzol一步法提取细胞总RNA,所获RNA加入DNaseⅠ消化处理可能污染的DNA后,PCR产物行琼脂糖电泳检测白细胞介素10 mRNA的表达.结果:①重组腺病毒的包装及滴度测定:经限制性内切酶转染293细胞16 h后,荧光显微镜观察到细胞中有GFP荧光,可间接反映目的基因的表达.将病毒上清反复感染293细胞扩增重组腺病毒,通常传至第4～5代于接种病毒后24～48 h,几乎可观察到所有细胞出现荧光,此时收获病毒,重组病毒命名为vAd-IL-10.vAd-IL-10滴度为5.5×108 pfu/mL,vAd-GFP滴度为9.0×108 pfu/mL.②目的基因RT-PCR产物的鉴定:提取重组腺病毒感染293细胞总RNA,RT-PCR扩增后琼脂糖电泳显示特异性580 bp预计大小的片段,表明该重组腺病毒可在293细胞中有效转录.结论:利用AdEasy腺病毒载体系统成功构建了携带白细胞介素10基因的重组腺病毒载体,并制备出高滴度的重组腺病毒vAd-IL-10,可在293细胞中有效转录.     

新发1型糖尿病儿童酮症酸中毒的相关因素分析

目的研究新发1型糖尿病酮症酸中毒(diabetic ketoacidosis,DKA)的临床特点并进行相关因素分析。方法回顾性分析2017年10月至2018年10月广东省广州市妇女儿童医疗中心遗传与内分泌科收治的81例儿童新发1型糖尿病患儿的临床资料,按照有无DKA进行分组,比较两组间年龄、性别、前驱感染史、糖尿病家族史、误诊或漏诊率、C肽水平、糖化血红蛋白等的差异,DKA组根据酸中毒程度分为轻度、中度、重度3个亚组,比较三组DKA患儿的实验室特点。结果 81例1型糖尿病患儿中有48例(59.2%)以DKA起病(DKA组),男25例,女23例;非DKA组33例,男18例,女15例。DKA组中轻、中、重度DKA者分别占18.8%、37.5%和43.7%。DKA组与非DKA组患儿的误诊或漏诊率分别为47.9%、18.2%,差别有显著性(P<0.05)。DKA组有19例(39.5%)患儿有前驱感染史,非DKA组有7例(21.1%)。与非DKA患儿比较,DKA组随机血糖更高,pH、HCO3-及C肽水平更低,差异均有显著性(P<0.05)。结论本院1型糖尿病患儿发病时DKA的发生率高,且以重度为主。有前驱感染症状,年龄<3岁,C肽水平低,存在漏诊、误诊是DKA重症的危险因素。     

儿童1型糖尿病酮症酸中毒合并低磷血症临床研究

目的 总结儿童1型糖尿病酮症酸中毒（DKA）合并低磷血症的临床特点,探讨DKA治疗期间低磷血症的发生率及预后。方法 回顾性分析2016年1月至2020年6月于广州市妇女儿童医疗中心遗传与内分泌科住院治疗的133例合并DKA的1型糖尿病患儿临床资料,分析入院后4～24h血磷水平,并对影响儿童血磷变化的相关因素进行分析。结果 133例DKA患儿中男55例（41%）,女78例（59%）,年龄6月龄至15岁,平均年龄（6.7±3.9）岁,新发1型糖尿病占72%。75例（56%）患儿出现血磷降低,其中41例（31%）患儿血磷0.81～1.29 mmol/L,22例（16%）患儿血磷0.61～0.81mmol/L,10例（7.5%）患儿血磷0.38～0.61mmol/L,2例（1.5%）患儿血磷<0.38mmol/L。正常血磷组与低血磷组之间pH值、碳酸氢根（HCO3-）、碱剩余（BE-B）、血钾、血氯差异均有统计学意义。酸中毒、年龄≤5岁为影响儿童DKA时血磷降低严重程度的危险因素。75例低血磷患儿均未出现低磷血症相关临床症状,未补充磷酸盐治疗。34例血磷<0.81mmol/L的患儿...     

大剂量丙种球蛋白替代换血治愈新生儿Rh(抗D)不合溶血病一例

病例摘要　男，２２小时，因皮肤发黄８小时入院。患儿系第２胎第２产，孕３９＋２周臀位助产分娩。生后无窒息，全身无苍白及水肿。Ａｐｇａｒ评分１～５分钟均为１０分，出生体重为２９００克。于生后１４小时发现面部发黄，迅速遍及全身。查体：全身皮肤及巩膜黄染。呼吸平稳，头颅、心肺正常，腹软，肝肋下及剑下均为１ｃｍ，质软，边锐，脾未触及。四肢肌张力不高，拥抱及觅食反射存在。入院查体：血型母血Ｒｈ阴性、Ｂ型。子为Ｒｈ阳性，Ｂ型，患儿直接抗人球蛋白试验、抗体释放试验及游离抗体试验均为阳性。母、子抗Ｄ抗体效价均在１…     

新生儿高胆红素血症的脑电图变化及分析

为探讨新生儿高胆红素血症的脑电图变化 ,自 1996年以来 ,我们对 46例高胆红素血症患儿进行了脑电图监测 ,现将结果报道如下。临床资料 :1996年 7月至 1997年11月我院新生儿室及ＮＩＣＵ收治的高胆红素血症患儿共 46例 (称高胆组 ) ,其中男 2 7例 ,女 19例 ,日龄≤ 3天 2 2例 ,4～ 7天 2 4例 ,胎龄 38～ 42周 ,体重 2 5 0 0～ 40 0 0ｇ。血清总胆红素水平在 2 16～388μｍｏｌ/Ｌ ,其中≤ 342 μｍｏｌ/Ｌ33例 ,>342 μｍｏｌ/Ｌ13例。所有病例均无胆红素脑病症状 ,除外窒息、颅脑疾病、低血糖、红细胞增多症、代谢性疾病及先天畸形。黄疸原…     

大剂量静注免疫球蛋白治疗新生儿ABO溶血病的疗效观察

本文对大剂量静脉注射免疫球蛋白（ＩＶＩＧ）治疗新生儿ＡＢＯ溶血病（ＡＢＯＨＤＮ）进行了观察。治疗组２１例在光疗、白蛋白治疗的基础上，给予ＩＶＩＧ治疗，首次１ｇ／ｋｇ，以后每次４００ｍｇ／ｋｇ，每日１次，共用２～４次。结果治疗组无１例换血，全部治愈，而对照组２例发生核黄疸，其中１例死亡，在黄疸消失时间及住院天数方面，两组有显著性差异（Ｐ＜００１）。提示ＩＶＩＧ可明显减少溶血，降低胆红素浓度，减少核黄疸的发生，对重症病例可起到替代换血的作用     

荧光定量聚合酶链反应对单纯疱疹病毒性脑炎的诊断

单纯疱疹病毒性脑炎 (ＨＳＶＥ)是由单纯疱疹病毒 (ＨＳＶ)感染所致的一种重型脑炎 ,其在临床上的地位日益受到重视 ,随着检验手段的提高 ,ＨＳＶＥ有增多趋势 ,我们采用荧光定量聚合酶链反应 (ＦＱＰＣＲ)法检测病毒性脑炎患儿4 5例 ,其中ＨＳＶＥ 16例 ( 3 5 6% ) ,现分析如下。1　资料及方法1 1　ＨＳＶＥ诊断标准　有中枢神经系统感染的临床表现 ,脑脊液 (ＣＳＦ)检查ＰＣＲＨＳＶ -ＤＮＡ + 〔1〕。1 2　对象　 1998年 1月— 2 0 0 0年 10月儿科病房收治的ＨＳＶＥ患儿 16例 ,其中男 9例 ,女 7例。发病年龄 1～ 3岁 2例 ( 12 5 % ) ,…     

腺病毒介导的白细胞介素10基因转移对胰岛β细胞凋亡及胰岛素释放的影响

Objective To evaluate the efficacy of adenovirus vector-mediated murine interleukin-10 (mIL-10) gene transfer to rat beta cell-RINm5F cells in vitro and to explore the potential value of gene therapy in type 1 diabetes mellitus. Methods The recombinant adenovirus vector Ad-mIL-10 was constructed and transfected into RINm5F cells (Ad-mIL-10 group). Untransfected RINm5F cells and Ad-eGFP-transfected cells were used as controls. The expression of mIL-10 was examined by RT-PCR and Western blot The levels of IL-10 in supernatant were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). For a determination of insulin release, the cells were cultured with high glucose ( 16. 7mmol/L) for a 1 -hour co-incubation. Then radioimmunoassay was used to detect the level of insulin in supernatant After induction of IL-1β, the levels of nitric oxide (NO) and nitric oxide synthase ( NOS) were measured, the apoptosis of transfected cells was detected by Hoechst 33258 staining and Fas expression by flow cytometry. Results Both mRNA and protein of Ad-mIL-10 were successfully expressed in RINm5F cells. Expression of mIL-10 gene resulted in significant increases in insulin secretion in response to high glucose. Compared with uninfected control and Ad-eGFP infected group, Ad-mIL-10 infected group had decreased levels of NO and NOS induced by IL-lβ [ NO level ( nmol/106 cells): 52. 9 ± 3. 2 vs 227. 3 ± 26. 4, 235. 1 ±28.6, both P＜0.05; NOS level (U/106 cells): 9. 3 ±1.2 vs 29. 8 ±2.5, 30.5 ±2.8, both P ＜ 0. 05]. Furthermore, Ad-mIL-10 gene transfer led to a profound reduction of Fas-expressing islet cells under the induction of IL-1β. Fas-expressing islet cells in Ad-mIL-10 group were significantly lower than those in uninfected group and Ad-eGFP-transfected group (24. 6% ± 1.0% vs 33. 3% ± 5. 1% , 32. 6% ±1.1%) (P＜0.05).The apoptotic rates of Ad-mIL-10 group were lower in comparison with the other two groups (9.4%±1.1% vs 19.2%±2.2%,20.6%±2.3%,P＜0.05).Conclusions IL-10 gene transfer to islet beta cells may be beneficial in maintaining beta cells function,protecting islet cells from IL-1β-mediated apoptosis and promoting islet cells survival.It is a potential therapy for type 1 diabetes mellitus.