软骨细胞形态、表型与胞间通讯的研究

背景在体外培养时软骨细胞会像成纤维细胞样成片生长并失去表型,软骨细胞胞间通讯与细胞表型的关系尚无报告.目的了解体外培养的不同形态的软骨细胞的增殖、基质合成、荧光染料摄入以及缝隙连接的关系.设计以诊断为依据的实验研究.地点和对象实验在解放军总医院骨科研究所和基础研究所完成,实验对象为兔关节软骨细胞,人股骨头软骨.干预体外培养的兔软骨细胞,分别进行苏木精-伊红(HE)、亮绿-藩红花O染色,显微镜下测量细胞大小、激光共聚焦显微镜下测量细胞内的荧光强度.激光淬灭软骨细胞内的荧光染料.主要观察指标软骨细胞的外观、细胞大小、细胞内的荧光强度.结果细胞投影面积测量软骨细胞变大,失去球形外观后增殖加快,平均面积1755.1 μm2,投影面积差别可达50倍.基质合成消失,缝隙连接消失.显微镜下软骨细胞的荧光强度测量球形软骨细胞CFDA-AM摄入多,(平均2057/30个细胞),扁平细胞摄入少(平均83/30个细胞).体外培养的球形兔软骨细胞间,人关节软骨生发层陷窝内的细胞间有胞间通讯.结论软骨细胞的密度、形态、表型和缝隙连接之间有一定的关系.而细胞外形可能决定细胞的表型.     

骨缺损修复机制探讨

目的通过引导性骨再生和组织工程软骨移植研究长骨骨缺损的修复机制。方法实验组在几丁质纤维载体上增殖21d的新生兔关节-干骺端复合物的软骨细胞(含载体)被装入硅胶管内,移植到成年兔桡骨干1cm的缺损上,对照组骨缺损处仅套接空套管。结果实验组术后4周时3例移植的软骨细胞在骨缺损内均形成软骨样组织,术后16周时9例中仅2例缺损愈合。对照组术后16周时9例(空套管)均骨性愈合。新生兔四肢关节-干骺端软骨细胞移植到同种成年兔桡骨缺损区后未修复骨缺损,未再现软骨内化骨过程。同时移植物可能因为占据空间、防止骨髓的成骨成分进入等原因中断了骨缺损修复过程。结论骨缺损的修复可能是先由骨膜增生形成成骨空间,然后由骨髓成分成骨,也就是一个在骨膜保护下的骨髓作用为主的天然的引导性骨再生过程。     

人股骨头坏死微观结构及成骨、破骨细胞活性的区域性分布特征

 目的 比较人股骨头坏死标本不同区域的骨微观结构及成、破骨细胞活性。方法 收集2011年3月至2013年5月行全髋关节置换的非创伤性股骨头坏死患者术后的股骨头标本10例（Ficat Ⅳ期）,男6例,女4例;年龄40～57岁,平均47.7岁。Micro-CT扫描后,根据影像学识别骨质密度不同,将每个标本分为软骨下骨区、坏死区、硬化区、健康区,通过病理学检测、纳米压痕、实时荧光定量PCR、免疫组化染色等方法对不同区域的骨微观结构、微观力学性能及成骨、破骨细胞活性进行比较。结果 Micro-CT结果显示,股骨头坏死标本软骨下骨区及坏死区的骨小梁连续性破坏;硬化区的骨小梁数目增多,间隙变窄;正常区域骨小梁结构完整,厚度分布均匀。软骨下骨区、坏死区、硬化区和健康区骨小梁的弹性模量分别为（13.808±4.22） GPa、（13.999±3.816） GPa、（17.266±3.533） GPa和（11.927±1.743） GPa;硬度分别为（0.425±0.173） GPa、（0.331±0.173） GPa、（0.661±0.208） GPa和（0.423±0.088） GPa。抗酒石酸酸性磷酸酶（Trap）染色结果显示,软骨下骨区和坏死区可见Trap染色阳性细胞,硬化区及健康区未见Trap染色阳性细胞。免疫组化染色结果显示,骨形成相关因子Runx2和BMP2在硬化区及健康区表达高于其他区域;骨吸收相关因子RANK和RANKL在软骨下骨区及坏死区表达高于其他区域。结论 股骨头坏死塌陷过程中,骨微观结构发生明显改变,而坏死区骨小梁微观力学强度较健康区无显著降低。股骨头坏死标本中软骨下骨区及坏死区破骨细胞活性增强,硬化区成骨细胞活性增强。     

自创脊柱手术后图文数据库与评分调查表系统

目的 开发实用可靠的自动化脊柱手术后疾病登记系统，以使资源发挥最大的作用。方法 应用计算机WindowXP操作系统，以Microsoft Office Access2003(简体中文版)数据库软件作为编辑软件。包括：创建数据表、输入数据窗体及功能按钮，建立查询及打印；建立WORD文档以适应：SRS脊柱侧凸24项评分；神经根型颈椎病JOA评分；腰背、2．0版本Oswestry下肢功能障碍评分；脊髓型颈椎病JOA评分；病历随访等的表格模板。建立图片数据库以OEL链接、超级链接一并于数据库存盘。结果 将所需数据查询结果导入EXCEL电子表格分类汇总与计算合并，完成手术后各项评分，随访结果；导入WORD文档模版将打印各种表格输出，对进行多媒体教学与撰写科研论文具有极大的意义。结论 本系统是对脊柱疾病资料登记小型管理的有效方法之一。     

聚乳酸载体在组织工程骺软骨研究中的应用

目的了解聚乳酸是否可以用作骨骺软骨细胞的载体。方法采用多孔聚乳酸膜片作载体,与骨骺软骨细胞共培养,通过组织学、透射电镜、扫描电镜观察细胞与载体的关系及细胞生长情况;通过凝胶渗透色谱法了解聚乳酸载体肌肉植入后分子量改变情况和局部反应。结果倒置显微镜、组织学及电镜观察均显示细胞可以在载体上生长,并且分泌基质;聚乳酸载体植入体内后分子量逐渐减少,周围异物细胞较少。结论首次成功地培养出了组织工程骺软骨;聚乳酸在体内可以不断降解,组织相容性较好;骨骺软骨细胞可以在载体上不断生长。     

原位定量评价组织工程研究中细胞生长状态的新方法

目的探讨一种能原位定量评定细胞在高分子聚合物载体上生长情况的方法。方法采用CFDA-AM和PI双染结合激光扫描共聚焦显微镜技术,用平均荧光强度代表细胞数量,对组织工程骺软骨中骨骺软骨细胞在聚乳酸载体上1、2及3周时的死活细胞数量进行评价。结果骨骺软骨细胞在聚乳酸载体上的530nm的平均荧光强度随时间逐渐增加,而603nm的荧光强度在第2周时有所增加,而到第3周时则无明显增加。与细胞在载体上重量增加的结果一致。结论首次采用的原位定量检测载体上死活细胞的方法是可行的,解决了在不透明载体上即不影响细胞和载体结构,而可以原位快速定量评定细胞生长的难题。     

异体冷冻干燥松质骨移植治疗脊柱结核的中长期随访

目的:了解将异体冷冻干燥松质骨装填于钛网内,用于胸、腰椎结核手术前路支撑植骨,在完成脊柱重建和促进骨愈合方面的作用。方法:选择1999-01/2005-03解放军总医院骨科接受胸、腰椎结核病灶根治性清创,并采用冷冻干燥异体松质骨进行植骨融合的胸、腰椎结核患者24例进行信件和电话随访,其中19例患者完成随访。胸椎结核11例,腰椎结核8例。胸椎结核患者采用前方经胸腔入路或前方经胸膜外入路(用于T12的显露)进行病灶清除,钛网加异体骨植入,前路内固定。腰椎结核患者采用前方经腹膜后入路,钛网加异体骨植入,前路或前、后联合内固定。采用钛网菱形网格沉入终板的相对比值来表示钛网的沉降值,钛网菱形网格高度的测量值为9mm。分别测量钛网在头侧和尾侧终板上的沉降值。评估异体骨的融合情况:Ⅰ级为骨质融合,并有骨小梁影像;Ⅱ级为植骨完好,未见完全的骨质重塑和融合,但交界面没有透光区;Ⅲ级为植骨完好,但在移植骨的上、下端与受区骨的交界面处有透光区;Ⅳ级无任何骨融合迹象,移植骨吸收。结果:19例患者接受至少30个月的随访(30～73个月),平均随访51.2个月,随访率79.2%。①患者术后住院时间为6～26d(平均10.1d)。②最终随访患者的X射线片显示钛网在头侧终板的下沉为(0.60±0.06)个菱形网格高度,在尾侧终板的下沉为(0.40±0.06)个菱形网格高度,钛网平均总下沉高度为1.0个菱形网格高度,即绝对高度为9mm。③19例患者在末次随访时均观察到骨融合现象,X射线片显示在钛网旁可见骨桥形成,或者钛网两端与椎体的交界面模糊。胸椎骨融合Ⅰ级9例,Ⅱ级2例;腰椎骨融合Ⅰ级6例,Ⅱ级2例。结论:异体冷冻干燥松质骨装填入钛网或人工椎体可有效地应用于脊柱结核的前路椎体重建术,为了使植骨达到良好的再生和重塑,应进行稳固的内固定。     

新鲜异体和自体骨软骨移植修复软骨缺损的差异评价

目的：通过压配技术进行移植修复，并评价新鲜异体和自体骨软骨移植修复软骨缺损的差别。方法：实验于2004—01／05在解放军总医院骨科研究所完成。采用20只成年健康新西兰兔，随机分成2组，自体移植组和异体移植组，每组10只。制备髌股关节面的股骨槽沟内直径4mm的软骨缺损的动物模型，①自体移植组在手术过程中取兔右侧关节的骨软骨块植入左侧的股骨槽沟缺损骨洞内，并与股骨槽沟软骨面平齐，闭合切口。②异体移植组在手术过程中采用组内配对将配对兔右侧膝关节取出的骨软骨块经乳酸林格氏液冲洗后，植入同组配对兔左膝的缺损内，同样将同组配对兔右膝取出的备用软骨植入配对兔左膝的缺损内。③于手术后12周观察移植后兔的关节活动度、关节腔积液情况，关节挛缩、粘连及血管翳形成情况。修复组织的质地以及周围组织和基底部的结合程度。髌骨面的退变情况。观察软骨基质分泌情况应用苏木精一伊红染色和番红O染色。缺损处修复组织的超微结构行透射电镜观察。软骨缺损的组织学评分以半定量的改良Wakitani score法评估，内容包括：细胞种类，髓质染色（易染性），表面完整性，软骨的厚度，移植软骨在受体周围组织的完整性6个方面19项内容，采用0，1，2，3，4评分，最大总分14分。结果：所有动物在实验过程中全部成活，均进入结果分析。①移植软骨情况的大体观察：异体移植组移植后局部高度及颜色已与正常软骨一致，平滑且结合紧密，与周围及基底部界限模糊且质地坚硬。关节囊正常。自体移植组移植块无陷落，无倾斜，仍然完整，厚度不变。②移植后软骨的微观结构：光镜观察可见两组移植软骨均已覆盖缺损，与正常软骨高度相当，缝隙已接近连接，细胞成熟，有大量软骨基质分泌，细胞排列规则，番红O着色深。周围无淋巴细胞和浆细胞浸润。自体移植组移植软骨与正常软骨的边缘之间形成锐利边缘的微裂，软骨基质没有能融合一体。透射电镜观察可见异体移植组见软骨细胞位于陷窝内，清晰，呈扁平状。细胞表面有多个突起，核呈椭圆形，染色质分布均匀，粗面内质网呈扩张状态，腔内有中等电子密度的分泌物，可见高尔基复合体。基质中可见胶原纤维存在。在成熟软骨细胞中可见细胞分裂象，并可见许多电子密度高的颗粒。自体移植组所见与异体移植组相同。③移植软骨的组织学评分结果：于12周观察自体移植组和异体移植组在组织学方面评分，细胞种类，髓质染色（易染性），表面完整性，软骨的厚度，移植软骨在受体周围组织的完整性评分相似，总评分相近（3．9，4．3，P=2．295）。结论：①同种关节软骨移植后可完全修复全层关节软骨缺损，软骨细胞存活，可分泌软骨基质，其形态与生物学特性类似于正常软骨细胞。（爹异体骨软骨移植后近期存活良好，并与自体骨软骨移植修复新西兰兔的全软骨缺损在组织学上相近，未见免疫排斥反应，故说明新鲜异体骨软骨也可以作为移植的供体修复骨缺损。     

膝关节不稳早期软骨下骨生化学和生物力学的变化

目的:了解膝关节不稳早期软骨下骨生化学和生物力学的变化。方法:复制兔膝关节不稳模型,利用Instron力学材料机进行胫骨髁软骨主要负重区相对应的软骨下骨的压迫实验,测定软骨下骨的压缩强度和压缩模量。同时测定软骨下骨的糖醛酸、羟脯氨酸和吡啶并林的含量。结果:软骨下骨的压缩强度和压缩模量在模型术后1周分别平均下降40%和33.7%,均与正常对照有非常显著差别(P<0.01)。但是随着时间的延长,软骨下骨压缩强度和压缩模量却呈现逐渐增高的趋势。软骨下骨糖醛酸及羟脯氨酸含量在模型术后升高,而软骨下骨吡啶并林含量于模型术后1周却迅速下降69.4%。随后其含量逐渐上升。结论:膝关节不稳早期即可出现软骨下骨生物力学和生化学的改变,这可能与软骨下骨在异常应力下骨代谢的改变有关。     

多媒体数字化系统在细胞生物技术研究中的应用

目的 在细胞生物学研究中，利用先进的多媒体技术对传统的图像资料采集方法进行改革，提高资料采集、储存和保管的质量。方法 实验于2002-02／2004-05在解放军总医院全军骨科研究所完成。利用计算机、数码照相机、扫描仪、刻录仪、计算机图像采集系统、彩色激光打印机及各种软件收集和再现各方面的信息资料，按研究目的制作不同数据库及多媒体文件，建立影像资料库，简化资料的处理过程。结果 2002-02起建立细胞生物学多媒体数字化系统，截至2004-05，累计采集图像16万张，相关资料容量60G。结论 此套系统效率高，成本低，技术易掌握，资料分类、保存、查找容易，便于医学科研工作。