载脂蛋白A-Ⅰ对高糖环境下人视网膜血管内皮细胞生物行为及VEGF表达的抑制作用

背景 视网膜血管内皮细胞(RVECs)是视网膜微血管的主要成分,通过增生、迁移以及血管发生等生物行为在糖尿病视网膜病变(DR)的发生和发展中发挥关键作用.载脂蛋白A-Ⅰ (ApoA-Ⅰ)是高密度脂蛋白中主要的载脂蛋白,既往研究表明ApoA-Ⅰ在糖尿病患者视网膜组织内呈高表达,且在不同微环境中对RVECs发挥不同作用,但其在高糖环境下与RVECs生物学行为的关系仍不清楚. 目的 研究ApoA-Ⅰ对高糖环境下培养的人RVECs(hRVECs)生物行为及血管内皮生长因子(VEGF)表达的抑制作用. 方法 用含体积分数10％胎牛血清的DMEM体外培养hRVECs并传代,取3～6代细胞用于实验.将培养的细胞分为低糖组、低糖+ApoA-Ⅰ组、高糖组和高糖+ApoA-Ⅰ组,按照分组分别在DMEM中添加葡萄糖和ApoA-Ⅰ,低糖浓度为5 mmol/L,高糖浓度为25 mmol/L,ApoA-Ⅰ终质量浓度为30 μg/ml.采用细胞计数试剂盒-8、CCK-8法检测细胞增生能力(吸光度,A值);采用细胞划痕法检测细胞的迁移率;采用管腔形成实验检测培养细胞的体外成管能力;分别采用实时荧光定量PCR法和Western blot法检测各组细胞中VEGF mRNA及其蛋白的相对表达量.结果 高糖组细胞增生值(A值)和细胞迁移率明显高于低糖组,高糖+ApoA-Ⅰ组细胞增生值和细胞迁移率明显低于高糖组,差异均有统计学意义(A值:P=0.001、0.033;迁移率:P=0.001、0.010).低糖组、低糖+ApoA-Ⅰ组、高糖组和高糖+ApoA-Ⅰ组管腔数分别为(7.250±2.217)、(9.250±2.630)、(19.000±3.916)和(11.500±3.697)个,组间总体比较差异有统计学意义(F=10.335,P=0.001).高糖组管腔数较低糖组显著增加,高糖+ApoA-Ⅰ组较高糖组管腔数显著减少,差异均有统计学意义(P=0.001、0.037).低糖组、低糖+ApoA-Ⅰ组、高糖组和高糖+ApoA-Ⅰ组细胞中VEGF mRNA相对表达量分别为0.944±0.083、1.117±0.204、1.768±0.164和1.301±0.077,VEGF蛋白相对表达量分别为1.000±0.130、1.217±0.152、1.871+0.101和1.609±0.087,组间总体比较差异均有统计学意义(mRNA:F=18.640,P=0.001;蛋白:F=10.335,P=0.001),其中高糖组细胞中VEGF mRNA及其蛋白的相对表达量均明显高于低糖组和高糖+ApoA-Ⅰ组,差异均有统计学意义(mRNA:P=0.000、0.004;蛋白:P=0.000、0.029). 结论 ApoA-Ⅰ对高糖环境下hRVECs的增生、迁移及管腔形成具有抑制作用,可能与其下调细胞VEGF的表达有关.     

组织块半悬浮培养法分离培养大鼠视网膜血管内皮细胞

目的　利用组织块半悬浮培养法分离培养大鼠视网膜血管内皮细胞。方法　分离大鼠视网膜并剪碎,将４～５个碎块半悬浮培养,培养基为含有体积分数１０％胎牛血清并滴加重组牛碱性成纤维细胞生长因子的ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养液,获得的细胞用Ⅷ因子相关抗体鉴定,并使用传统冻存及复苏的方法保存。结果　２４ｈ组织块生长固定在培养皿中,６ｄ可见细胞从组织块边缘游出,并可见多个细胞集落,１６ｄ基本铺满培养皿。Ⅷ因子相关抗体染色阳性,细胞可持续生长并传代。结论　用组织块半悬浮培养法可以简便的获得视网膜血管内皮细胞,所获细胞性状稳定,可用于进一步实验研究。