N-乙酰-5-羟色胺对视网膜缺血-再灌注损伤大鼠视网膜 Fas、FasL 蛋白表达的影响

目的　探讨N-乙酰-5-羟色胺（N-acetylserotonin，NAS）对视网膜缺血-再灌注损伤（retina ischemia-reperfusion injury，RIRI）大鼠视网膜Fas、FasL蛋白表达的影响。方法　取健康成年Sprague Dawley大鼠54只，将大鼠随机分为正常组（6只）、RIRI组（24只）与NAS组（24只）；采用高眼压法建立大鼠RIRI模型，依据造模后不同时间点将RIRI组与NAS组大鼠又分为6 h、12 h、24 h及72 h四个亚组。NAS组于造模前30 min腹腔注射NAS（5 mg·kg^-1），RIRI组腹腔注射等剂量的生理盐水。通过HE染色在光学显微镜下观察各组大鼠视网膜形态学变化，并记录各组大鼠视网膜厚度及视网膜神经节细胞数，采用免疫组织化学染色法检测NAS对RIRI大鼠视网膜Fas、FasL蛋白表达的影响。结果　HE染色显示，正常组大鼠视网膜各层细胞分界清晰，形态正常，神经细胞排列整齐；RIRI组大鼠再灌注后6 h视网膜各层出现水肿，以神经节细胞层及内核层较显著，神经节细胞数较正常组减少；随后视网膜水肿进一步加重，神经节细胞继续减少；NAS组大鼠在再灌注后6 h、12 h、24 h 视网膜水肿程度较 RIRI组轻，NAS组在再灌注后72 h视网膜厚度较 RIRI组厚，NAS组各时间点神经节细胞数均较 RIRI组多，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。免疫组织化学染色显示，正常组几乎未见 Fas⁺细胞。再灌注后6 h，RIRI组视网膜神经节细胞及内核层开始出现少量 Fas⁺细胞；再灌注后12 h，RIRI组视网膜 Fas⁺细胞表达逐渐增多；再灌注后24 h视网膜Fas⁺细胞数达到高峰，棕色阳性染色细胞分布在视网膜神经节细胞层、内丛状层、内核层及神经纤维层；再灌注后 72 h 视网膜 Fas⁺细胞较再灌注后 24 h 减少。NAS组在再灌注后6 h、12 h、24 h、72 h 视网膜 Fas⁺细胞数均较 RIRI组各时间点减少，再灌注后24 h，Fas⁺细胞数达较高水平，随后下降，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。正常组视网膜可见 FasL 全层低表达。RIRI组再灌注后 6 h，视网膜神经节细胞层和神经纤维层存在少量 FasL⁺细胞；再灌注后12 h FasL蛋白表达逐渐增多；再灌注后24 h FasL⁺细胞数达高峰，可见深棕色的细胞膜及细胞质染色细胞分布在视网膜神经节细胞层、内丛状层、内核层及神经纤维层；再灌注后72 h FasL蛋白的阳性表达逐渐减少。NAS组再灌注后6 h、12 h、24 h、72 h 视网膜FasL⁺细胞数均少于 RIRI组各时间点阳性细胞数，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。结论　NAS可通过抑制RIRI大鼠视网膜细胞Fas、FasL蛋白的表达，减轻缺血再灌注对大鼠视网膜细胞造成的损伤。     

EB病毒潜伏膜蛋白2多表位DNA联合多肽的免疫效应研究

目的研究HPV L1携带EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白2(LMP2)多表位DNA联合多肽的免疫效应。方法BALB/c雌性小鼠随机分为4组。pcHPVL1-EBV LMP2DNA免疫组,肌肉注射pcDNA3.1(+)/HPVL1-EBV LMP2多表位DNA,每鼠每次100μg;DNA联合多肽免疫组:先用DNA免疫,每鼠每次50μg,同时皮下注射EBV LMP2多表位肽,每鼠每次5μg;DNA免疫对照组:肌肉免疫空载体pcDNA3.1(+),每鼠每次100μg;多肽免疫对照组:每鼠每次10μg皮下注射不相关多肽。共免疫4次,间隔2周。免疫后第7周收集小鼠血清,采用ELISA法检测小鼠EBV LMP2特异性抗体IgG、IgA以及HPVL1特异性抗体IgG;免疫后第9周测定EBV特异性抗体IgG1与IgG2a亚类,同时采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定小鼠脾细胞CTL的杀伤活性。结果多肽联合DNA免疫组小鼠血清EBV LMP2特异性抗体IgG、IgA A值分别为1.573±0.025和0.436±0.033,单独DNA免疫组分别为1.282±0.051和0.317±0.022,差异有统计学意义(F=80.393,27.722,P<0.05);两免疫组小鼠血清HPV L1特异性IgG A值别为0.648±0.063和0.702±0.023,差异无统计学意义(F=1.952,P>0.05)。DNA免疫组IgG1和IgG2aA值别为0.723±0.023和0.594±0.084,差异无统计学意义(F=6.643,P>0.05),是混合Th1/Th2免疫反应类型;多肽联合DNA免疫组IgG1和IgG2aA值别为0.897±0.042和0.629±0.035,差异有统计学意义(F=72.306,P<0.05),是偏向Th2免疫反应类型。多肽联合DNA免疫组在效靶比为10︰1时,小鼠脾细胞CTL杀伤效应(杀伤率)为27.70%,DNA免疫组为21.50%,差异有统计学意义(F=51.559,P<0.05)。结论多肽联合DNA免疫可产生有效的CTL杀伤效应,更能发挥有效的体液免疫作用,其免疫策略可为EBV相关肿瘤的免疫治疗提供参考。     

血浆纤维蛋白原及同型半胱氨酸的检测在妊娠期高血压疾病中的意义

目的 探讨血浆纤维蛋白原(fibrinogen,FIB)及同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)对妊娠期高血压疾病评价作用,以期注重防范.方法 选取妊娠期高血压疾病患者110例作为研究对象,包括子痫前期轻度55例,子痫前期重度55例,并选取同时期正常晚期妊娠55例和妊娠期高血压55例作为对照,均抽取静脉血观察在FIB、Hcy含量变化情况.对子痫组均予硫酸镁治疗,并以同时期先兆流产55例患者作为对照,观察治疗后第3、7、10天在血清FIB、Hcy含量变化情况,观察两者和妊娠其高血压疾病相关性.结果 妊娠期高血压疾病患者血浆Hcy、FIB含量越高,疾病越严重,差异有统计学意义(P<0>.05),经硫酸镁治疗后,子痫前期轻度组、子痫前期重度组血清Hcy、FIB含量逐渐降低,和先兆流产组比较差异有统计学意义(P<0.05).妊娠高血压疾病与Hcy、FIB呈正相关(r值分别为8.936、9.244,P<0.05).结论 密切监测Hcy、FIB水平对预防、诊疗和动态监测有重要参考价值.     

不同N-乙酰-5-羟色胺(NAS)给药途径对大鼠视网膜缺血-再灌注损伤的影响

目的探讨腹腔与尾静脉注射N-乙酰-5-羟色胺(N-acetylserotonin,NAS)两种给药途径对大鼠视网膜缺血-再灌注损伤(retinal ischemia-reperfusion injury,RIRI)组织病理学、活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白表达及细胞凋亡的影响。方法健康无眼疾成年Sprague-Dawley雄性大鼠54只,采用随机数字表法分为正常对照组(n=6)、RIRI腹腔组(n=12)、RIRI静脉组(n=12)、NAS腹腔组(n=12)和NAS静脉组(n=12),后四组采用升高眼压法建立大鼠RIRI模型。NAS腹腔组、NAS静脉组于建模前30 min分别经腹腔、尾静脉注射NAS(10 mg·kg^-1),RIRI腹腔组、RIRI静脉组于造模前30 min分别经腹腔、尾静脉注射同等剂量的生理盐水。RIRI后24 h,采用免疫组织化学染色检测各组大鼠视网膜中活性Caspase-3的表达,TUNEL染色检测各组视网膜细胞凋亡情况;RIRI后7 d,HE染色观察各组视网膜组织病理学变化。结果HE染色结果示,正常对照组大鼠视网膜各层细胞排列整齐、规则;RIRI后7 d,RIRI腹腔组与RIRI静脉组大鼠视网膜细胞排列稀疏、紊乱,形态不规则,视网膜内层厚度变薄;NAS腹腔组视网膜细胞形态较规则,排列较规整;NAS静脉组视网膜各层形态及细胞排列均趋于正常。NAS静脉组视网膜内层厚度(91.67±1.43)μm显著高于NAS腹腔组(87.80±1.33)μm、RIRI腹腔组(82.37±1.09)μm和RIRI静脉组(82.81±0.90)μm,差异均具有统计学意义(均为P<0.05);且NAS静脉组视网膜神经节细胞数(616.90±79.51)个·mm^-2显著高于NAS腹腔组(529.25±92.05)个·mm^-2、RIRI静脉组(434.42±87.17)个·mm^-2、RIRI腹腔组(390.72±72.12)个·mm^-2,差异均具有统计学意义(均为P<0.05)。免疫组织化学染色结果发现,RIRI后24 h,NAS静脉组活性Caspase-3阳性细胞数(145.01±22.54)个·mm^-2少于NAS腹腔组(221.34±30.84)个·mm^-2,差异具有统计学意义(P<0.05),二者活性Caspase-3阳性细胞数均显著少于RIRI静脉组(380.54±41.25)个·mm^-2和RIRI腹腔组(387.79±26.72)个·mm^-2,差异均具有统计学意义(均为P<0.05)。TUNEL染色结果示,RIRI后24 h,NAS静脉组TUNEL染色阳性细胞数(1468.03±128.40)个·mm^-2少于NAS腹腔组(1968.96±254.98)个·mm^-2,差异具有统计学意义(P<0.05),二者TUNEL染色阳性细胞数均显著少于RIRI静脉组(2122.77±165.76)个·mm^-2和RIRI腹腔组(2140.53±177.96)个·mm^-2,差异均具有统计学意义(均为P<0.05)。结论腹腔及静脉注射NAS治疗均可减少视网膜细胞凋亡,从而减轻RIRI大鼠视网膜损伤,且静脉注射给药的疗效优于腹腔给药。     

EB病毒潜伏膜蛋白2多表位的原核表达及其抗原特性分析

目的 对EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白2(LMP2)中富含T、B细胞多表位肽段基因进行原核表达,并分析该多表位蛋白的抗原特性.方法 利用计算机在线软件预测EBV LMP2蛋白的CTL表位、Th表位.选取富含CTL表位和Th表位的肽段,兼顾其上下游已预测的B细胞表位,组成含多个T、B细胞表位的EBV LMP2多表位,该多表位基因序列经原核密码子优化后全序列合成,并克隆入原核表达载体pET32a(+)得到pET32a(+)/EBV-LMP2多表位重组质粒,经IPTG诱导在E.coli BL21(DE3)表达并纯化,经SDS-PAGE和Western blot分析鉴定;采用EBV膜蛋白家兔免疫血清和鼻咽癌患者血清进行Western blot分析其抗原特性;并利用EBV-LMP2多表位蛋白免疫BALB/c小鼠,分别采用LDH和ELISA方法检测小鼠脾细胞特异性CTL杀伤效应及血清特异性抗体IgG水平,以分析该表位蛋白的免疫原性.结果 LMP2(aa195-232)和LMP2(aa419-436)肽段富含CTL、Th和B细胞表位,将其串联后作为EBV LMP2多表位,该多表位基因在大肠杆菌中获得了表达.表达产物的相对分子质量(Mr)约27×103,与预期Mr相符;经Western blot证实EBV-LMP2多表位具有抗原特异性,可被EBV膜蛋白家兔免疫血清和鼻咽癌患者血清特异性抗体识别;小鼠免疫结果显示EBVLMP2多表位可诱导机体产生特异性的CTL杀伤效应,随着效靶比(1:5,1:10,1:25)增加,CTL杀伤活性逐渐增强(12.52%±2.59%,21.80%±1.08%,23.68%±3.74%),同时产生了特异性血清IgG抗体反应(A490=0.258±0.040),与对照组比较差异均具有统计学意义(P＜0.05).结论 本研究没计的EBV-LMP2多表位具有良好的抗原性和一定的免疫原性.     

不同剂量N-乙酰-5-羟色胺（NAS）对视网膜缺血-再灌注损伤大鼠视网膜细胞凋亡的影响

目的　探讨不同剂量N-乙酰-5-羟色胺（N-acetylserotonin,NAS）对视网膜缺血-再灌注损伤（retinal ischemia-reperfusion injury,RIRI）大鼠视网膜细胞凋亡的影响。方法　成年SD大鼠随机分为正常对照组、RIRI 组和 NAS 组。采用高眼压法建立RIRI大鼠模型。NAS组按照给药剂量的不同分为NAS低剂量组（5 mg·kg^-1）、NAS中剂量组（10 mg·kg^-1）和NAS高剂量组（20 mg·kg^-1）,造模前后30 min腹腔注射NAS。HE染色法观察各组大鼠视网膜形态学的改变,免疫组织化学法检测各组大鼠视网膜中活性Caspase-3的表达,TUNEL法检测各组视网膜细胞凋亡的变化。结果　HE染色结果显示,NAS中剂量组大鼠视网膜各层细胞排列最整齐,视网膜内层厚度［（53.24±1.68）μm］显著薄于RIRI组［（60.54±2.52）μm］及NAS低剂量组［（56.78±1.78）μm］（均为P<0.01）,NAS中剂量组视网膜神经节细胞数［（1113.65±74.40）个·mm^-2］显著多于RIRI组［（719.89±83.67）个·mm^-2］及NAS低剂量组［（882.09±55.62）个·mm^-2］（均为P<0.01）。免疫组织化学结果示,视网膜中活性Caspase-3阳性细胞数RIRI组［（246.08±19.23） 个·mm^-2］及NAS低、中、高剂量组［（196.95±19.83）个·mm^-2、（142.77±18.25）个·mm^-2、（133.10±15.19）个·mm^-2］均显著多于正常对照组［（95.37±10.93）个·mm^-2］（均为P<0.01）;NAS中剂量组视网膜中活性Caspase-3阳性细胞数量显著少于RIRI组及NAS低剂量组（均为P<0.01）。TUNEL检测结果显示,TUNEL阳性细胞数RIRI组［（225.45±18.93）个·mm^-2］及NAS低、中、高剂量组［（175.06±17.69）个·mm^-2、（108.85±13.41）个·mm^-2、（100.37±13.53）个·mm^-2］均多于正常对照组［（81.98±11.29）个·mm^-2］（均为P<0.01）;NAS中剂量组视网膜TUNEL阳性细胞数显著少于RIRI组及NAS低剂量组（均为P<0.01）。结论　腹腔注射NAS治疗可减轻RIRI大鼠视网膜细胞凋亡,具有神经保护作用,中剂量NAS治疗方案最佳。     

超敏C反应蛋白在妊娠期高血压疾病各阶段的变化及其意义

目的：研究妊娠期高血压疾病患者不同孕周超敏C反应蛋白的变化及其临床意义。方法：采用散射比浊法测定妊娠期高血压疾病患者及健康妊娠妇女不同孕周超敏C反应蛋白值,观察其变化。结果：妊娠期高血压疾病患者超敏C反应蛋白值在孕13-20周时就已明显高于健康妊娠妇女,差异有统计学意义（P〈0.05）。妊娠期高血压疾病患者产后超敏C反应蛋白值仍会维持高水平。结论：系统炎症反应在妊娠期高血压疾病的发生中具有重要作用,检测超敏C反应蛋白的变化对诊断、评估和治疗监测妊娠期高血压疾病具有重要的临床意义。     

妊娠期高血压治疗前后凝血指标的变化及意义

目的探讨妊娠期高血压妇女治疗前后凝血四项的变化及临床意义。方法 2010年8月—2012年8月在本院确诊为妊娠期高血压并在本院接受治疗的患者120例,其中妊娠期高血压组50例,轻度子痫前期组33例,重度子痫前期组37例。同期在本院收治的健康晚期妊娠妇女50例为正常晚孕组。采用SYSMEX-CA1500血凝仪对50例正常晚期妊娠妇女及120例妊娠期高血压疾病妇女进行凝血酶原时间（PT）、部分活化凝血酶原时间（APTT）、凝血酶时间（TT）、血浆纤维蛋白原（FIB）检测,妊娠期高血压妇女经治疗临床缓解后再进行凝血四项的检测分析。结果妊娠期高血压组与正常晚期妊娠妇女组比较PT,APTT,TT明显降低,差异有统计学意义（P〈0.05）,FIB值升高,差异有统计学意义（P〈0.05）;妊娠高血压妇女经治疗临床缓解后于正常晚期妊娠妇女组比较,PT,APTT,FIB,TT值差异无统计学意义（P〉0.05）。结论妊娠期高血压妇女存在明显的高凝状态,动态检测血凝指标的变化对早期诊断和治疗妊娠期高血压具有重要的临床意义。     

EBV潜伏膜蛋白2的结构与功能分析

目的：预测和分析EBV潜伏膜蛋白2（LMP2）的结构和功能。方法：采用互联网数据库和生物软件,从SwissProt蛋白质数据库中检索LMP2的氨基酸序列,通过生物软件分析预测其理化性质、二级结构及空间结构。结果：分析显示LMP2由497个氨基酸组成,分子量53 011.4 Da,等电点4.85,为疏水性蛋白;具有12个疏水跨膜区,其N端含有免疫受体酪氨酸活化基序（ITAM）和脯氨酸富集基序（PY基序）,前者位于氨基酸序列74～77和85～88处,后者位于56～60和97～101处;含有15个α螺旋结构和7个β片层结构,通过无规则卷曲连接α螺旋和β片层。结论：通过对LMP2生物信息学的分析,获得了此蛋白的理化特性及部分参与调节跨膜信号传导功能区的信息,为进一步研究EBV的感染与致病机制、研制EBV亚单位疫苗等奠定基础。