应用依赖随机化末端连接物聚合酶链反应技术研究重铬酸钾对大鼠肺p53基因DNA损伤

应用依赖随机化末端连接物PCR(RandomizedTerminalLinker-dependentPCR ,RDPCR)技术于体内试验的研究 ,从而检测特定基因的DNA损伤。腹腔注射重铬酸钾染毒大鼠 ,提取肺组织基因组DNA ,经p5 3基因外显子 7特异性引物P1重复直线延伸后与接头 (Linker)连接 ,用基因特异性引物P2和连接物引物经PCR扩增 ,电泳、转印 ,再与地高辛标记的探针杂交后显色。结果显示 ,在 2 0 .0mg kg和 40 .0mg kg剂量下 ,出现了两条清晰的杂交带 ,表明重铬酸钾可引起大鼠肺p5 3基因外显子 7的DNA损伤 ,且有两个损伤位点。此结果有助于进一步探讨六价铬化合物的致突变机制 ,同时也拓展了RDPCR技术在毒理学领域的应用     

RDPCR技术检测p53基因DNA损伤的研究

目前可资利用的检测特定基因ＤＮＡ损伤的手段较少。连接介导聚合酶链反应 (ｌｉｇａｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｄｐｏｌｙ ｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ ,ＬＭＰＣＲ)技术由于其灵敏度高和特异性强等优点 ,在研究ＤＮＡ加合物和氧化损伤等方面有较多报道[1～ 3] ,我们也成功地将其应用于检测ＤＮＡ链断裂[4 ] 。但该技术需用酶或化学方法处理在碱基修饰位点把ＤＮＡ链人为切断 ,限制了其应用[5] 。Ｇｒｉｍａｌｄｉ等[6 ] 改进设计的单链连接ＰＣＲ (ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄｌｉｇａｔｉｏｎＰＣＲ ,ＳＬＰＣＲ)技术 ,虽然克服…     

122. 建立RDPCR技术检测p53基因的DNA损伤

目的：设计、建立并初步评价能检测特定基因DNA损伤的随机末端连接物依赖的PCR（Randomized Terminal Linker－Dependent PCR,RDPCR）新技术。方法：培养TK6细胞并提取基因组DNA。用PCR技术扩增186bp的p53基因外显子7,以凝胶回收纯化的扩增产物为模板,再进行新的PCR反应标记地高辛探针,标记探针被电泳和定量。用限制性内切酶AfaI完全消化基因组DNA建立损伤模型;经过p53基因外显子7的特异性引物P1重复直线延伸,与一带有3′随机粘性末端的双链公共连接物（Linker）在T4 DNA连接酶作用下连接后,用基因特异性引物P2和连接物引物经PCR指数扩增;琼脂糖电泳,真空转印至带正电荷的尼龙膜上,再与地高辛标记的探针杂交后显色。结果：p53基因外显子7的扩增条带清晰,特异。标记探针的电泳速度稍慢于未标记片段;定量为50 μg/μl。RDPCR结果表明,使用3′末端阻止的Linker可见在相应位置出现了清晰的目标带,而未阻止的由于Linker的自身连接显色信号微弱;灰度计量显示RDPCR的信号强度是传统的连接介导聚合酶链反应（Ligation－mediated Polymerase Chain Reaction,LMPCR）的7倍,但其背景稍高。结论：RDPCR是在LMPCR、单链连接PCR(Single-strand Ligation PCR,SLPCR）和末端转移酶依赖的PCR （Terminal transferase-dependent PCR,TDPCR）技术上设计的新的体外扩增技术,可以有效检测特定基因的DNA损伤。它可能克服LMPCR、SLPCR和TDPCR各自的缺陷,如应用局限、连接效率低和定位不精确等,更为灵敏、简便、快速和适用。结合Maxam-Gilbert化学测序技术,RDPCR还能在核酸序列水平检测特定基因的DNA损伤,包括DNA加合物、链断裂和氧化损伤等,有很好的应用前景。     

单链连接PCR技术检测p53基因的DNA损伤

ＤＮＡ损伤 ,包括链断裂、氧化损伤和ＤＮＡ加合物等 ,是化学致癌过程中早期可检测的关键步骤[1] 。与肿瘤形成关系密切的原癌 抑癌基因 ,是致癌物重要的攻击靶 ,因此检则这些基因的ＤＮＡ损伤 ,对于研究致癌物的毒作用特点和分子机制 ,具有重要意义。然而 ,目前可资利用的检则特定基因ＤＮＡ损伤的手段较少。连接介导聚合酶链反应 (Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｄｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ ,ＬＭＰＣＲ)技术由于其灵敏度高、特导性强等优点 ,在研究ＤＮＡ加合物和氧化损伤等方面有较多报道[2 ,3 ] ,我们也成功…     

平阳霉素对p53基因外显子7的链断裂作用研究

特定基因链断裂与肿瘤的发生发展 ,以及遗传性疾病等密切相关 ,其检测具有重要的毒理学理论和实践意义。最近 ,我们建立了非放射性连接介导聚合酶链反应 (ｌｉｇａｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｄｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ ,ＬＭＰＣＲ)技术 ,以限制性内切酶消化基因组ＤＮＡ建立损伤模型 ,成功检测了ｐ5 3基因的链断裂[1 ] 。然而人类所接触的遗传毒物多为化学物质。如环境致癌因素中 80 %以上均为化学致癌物[2 ] ,且每年都有成百上千的新化合物出现 ,因此对化学断裂剂的检测尤为重要和实用。另一方面 ,在我们以前建立非…     

建立非放射性连接介导PCR技术检测p53基因链断裂

ＤＮＡ链断裂是一种严重的ＤＮＡ损伤。它可引起基因突变 ,ＤＮＡ重排 ,染色体结构异常乃至细胞死亡等。在常用的检测方法中 ,单细胞凝胶电泳技术具有灵敏、快速、简便、直观等优点 ,本室曾作过系统研究[1 ] 。但是 ,和其他常用方法一样 ,该技术也不能检测特定基因的ＤＮＡ链断裂。而一些重要的基因如癌基因和抑癌基因的ＤＮＡ损伤与致突变 致癌效应的关系非常密切 ,因此检测这些基因的ＤＮＡ链断裂可能更有利于阐明链断裂剂的作用特点和机制 ,具有更加重要的意义。国外有人利用连接介导聚合酶链反应 (Ｌｉｇａｔｉｏｎ ＭｅｄｉａｔｅｄＰ…     

建立RDPCR技术检测p53基因的DNA损伤

目的：设计、建立并初步评价能检测特定基因DNA损伤的随机末端连接物依赖的PCR（Randomized Terminal Linker-Dependent PCR,PDPCR)析技术。方法；培养TK6细胞并提取基因组DNA。用PCR技术扩增186bp的p53基因外显子7，以凝胶回收纯化的扩增产物为模板，再进行新的PCR反应标记地高辛探针，标记探针被电泳和定量，用限制性内切酶AfaI完全消化基因组DNA建立损伤模型；经过p53基因外显子7的特异性引物P1重复直线延伸，与一带有3'随机粘性末端的双链公共连接物（Linker)在T4 DNA连接酶作用下连接后，用基因特异性引物P2和连接物引物经PCR指数扩增；琼脂糖电泳，真空转印至带正电荷的尼龙膜上，再与地高辛标记的探针杂交后显色。结果：p53基因外显子7的扩增条带清晰，特异。标记探针的电泳速度稍慢于未标记片段。定量为50μg/μl。RDPCR结果表明，使用3'末端阻止的Linker可见在相应位置出现了清晰的目标带，而未阻止的由于Linker的自身连接显色信号微弱；灰度计量显示RDPCR的信息信号强度是传统的连接介导聚合酶链反应（Ligation-mediated Polymerase Chain Reaction,LMPCR)的7倍，但其背景稍高。结论：RDPCR是在LMPCR，单链连接PCR（Single-strand Ligation PCR,SLPCR)和末端转移酶依赖的PCR（Terminal transferase-dependent PCR,TDPCR)技术上设计的新的体外扩增技术，可以有效检测特定基因的DNA损伤。它可能克服LMPCR、SLPCR和TDPCR各自的缺陷，如应用局限、连接效率低和定位不精确率，更为灵敏、简便、快速和适用。结合Maxam-Gilbert化学测序技术，RDPCR还能在核酸序列水平检测特定基因的DNA损伤，包括DNA加合物、链断裂和氧化损伤等，有很好的应用前景。