乙型肝炎病毒全基因克隆及序列分析发现一D/C基因型重组株

目的 构建含有adr、adw、ayw3个血清型的HBV全基因组质粒，并进行测序及序列分析。方法 从HBsAg携带者的血清中扩增出S区克隆，筛选出adr、adw、ayw血清型的血清，然后扩增HBV的全基因组，对扩增产物进行克隆测序。利用DNAStar的MegAlign，Phylogenetic tree对HBV全基因序列以及分段序列进行比较和进化树分析。结果 构建了含有adw、adr、ayw 3种血清型的HBV全基因组质粒，代码分别为：H1、H2、H3，对3株完成序列测定，按照S区核苷酸顺序划分基因型分别为B、C、D，全序列分型显示H1、H2为B、C基因型，与按S区的分型一致，但H3为C基因型，与按S区的分型不同，进一步的序列分析表明H3为一株异常的基因型，按照S区和preS2区分型为D基因型，但是全基因组／C／P／X区的进化树分析，H3株均位于C基因型，提示该异常的基因型可能是由于D／C基因型间基因重组引起，对重组位点进行了分析：3181nt-10nt、799-834nt为可能的重组位点所在区。结论 H3病毒株的发现进一步证明了HBV基因型间的基因重组，但澄清该问题需要在HBV感染的高流行区进一步的积累HBV异常基因型的全序列，以及发现新的基因型资料。     

猪戊肝病毒的克隆和部分序列分析

目的：调查戊型肝炎病毒（HEV）对猪的感染情况。方法：用HEV抗体试剂盒检测猪血清中的抗体；用逆转录聚合酶链方法（RT－PCR）检测猪血清中的HEV RNA，对PCR阳性产物进行克隆测序，并对序列进行分析。结果：10份猪血清中有1份为HEV抗体阳性，2份为HEV RNA阳性，其中1份为抗体和RNA均阳性。序列分析显示，从猪中克隆的2株序列（G6和G8）之间在ORF1（102－387bp）和ORF2（6007－6354bp)区域的核苷酸序列的同源性分别为94％和93％，该2株序列在ORF1区在HEVⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅷ型的同源性分别为76％－79％、80％、79％－80％、88％－90％、75％－76％、79％、78％－79％和75％－78％；在ORF2区与Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型的同源性为75％－77％、74％－77％、77％－78％和84％－99％，与ⅣA亚型的同源性为93％－97％。结论：猪感染的HEV的基因序列与人群中散发性戊型肝炎病毒的ⅣA亚型同源性最高。     

戊型肝炎病毒Ⅳ型全基因序列的分析

目的 分析戊型肝炎病毒（HEV）Ⅳ型的全基因序列以比较与其他基因的差异。方法 设计PCR引物对全基因进行分自然扩增,并两个末端采用末端快速扩增方法（RACE）进行扩增,对扩增产物进行克隆及测序。结果 HEV－T1全序与Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型的核苷酸同源性分别为（74．8－75．5）％、74．5％和（75．3－76．3）％。ORF1与已报道的Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型氨基酸同源性分别为（85．0－86．7）％、85．0％和（88．5－88．7）％;ORF2与已报道的Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型的氨基酸同源性分别为（91．6－92．4）％、90．1％和（91．9－93．0）％。ORF3与已报道的Ⅰ型、Ⅱ和Ⅲ型的氨基酸同源性分别为（75．9－77．8）％、75．0％和（79．6－83．3）％。结论 这一研究为今后发展戊型料诊断试剂及戊型肝炎疫苗提供了新的、重要的分子生物学基础。     

新型戊型肝炎病毒ORF2部分基因的构建表达及表达产物的抗原性分析

目的对新型戊型肝炎病毒ORF2的3′端部分基因进行重组质粒构建及融合表达,并对表达蛋白进行抗原性分析。方法用PCR方法从含有HEVORF2基因的pGEM-T载体上扩增表达片段,双酶切后与原核表达载体pThioHisA构建重组质粒pThioHisA-T11。诱导表达后进行SDS-PAGE和免疫印迹分析。并用纯化的融合蛋白建立EIA检测方法,对40份抗-HEVIgG国家参比血清进行检测。结果含有pThioHisA-T11重组质粒的菌株表达相对分子质量为40×103的可溶性融合蛋白T11,免疫印迹证明融合蛋白T11能与抗HEVIgG发生特异反应。EIA检测结果显示,阳性参比血清符合率为80%(8/10),阴性参比血清符合率为87%(26/30),总符合率为85%。结论表达了新型HEVORF2羧基端278氨基酸并证明有抗原活性,为今后提高HEV检出率奠定了基础。     

庚型肝炎病毒(HGV)E2区cDNA的克隆与表达

目的　克隆ＨＧＶ Ｅ２ 基因并在原核细胞系统中表达ＨＧＶ Ｅ２ 蛋白。方法　从ＨＧＶＲＮＡ 阳性血浆中抽提病毒ＲＮＡ,利用半巢式ＲＴＰＣＲ 法扩增ＨＧＶ Ｅ２ 基因片段并进行序列分析。然后将该片段克隆到ｐＧＥＸ５ｘ１ 表达载体上,进行诱导表达。表达产物用抗ＨＧＶ 阳性血浆作Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 活性鉴定。结果　获得ＨＧＶ Ｅ２ Ｎ 端长度为７７９ 个核苷酸的基因片段。该片段与美国株ＨＧＶ（Ｕ４４４０２） 、西非株ＧＢＶＣ（ Ｕ３６３８０） 、中国株ＨＧＶ（ Ｕ７５３５６） 的核苷酸序列同源性分别为８４ ％ 、８５ ％ 、９１ ％ ,推测的氨基酸序列同源性分别为８８ ％ 、９３ ％ 、９４ ％ 。表达产物为相对分子质量约５０ ×１０３的ＧＳＴＥ２ 融合蛋白,在细胞内形成包涵体。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 反应中在约５０ ×１０３ 处有显色条带。结论本研究成功地在原核细胞系统中表达了具有抗原性的ＨＧＶ Ｅ２ 蛋白,为进一步研究ＨＧＶ Ｅ２ 蛋白及Ｅ２ 抗体的生物学功能打下了基础。     

乙型肝炎病毒S和前S1基因的融合构建及其在P. pastoris酵母中的表达

目的构建含有乙型肝炎病毒(HBV)S和前S1(preS1,10～50AA)表位的ss1融合基因,并在P.pastoris酵母中表达SS1融合蛋白。方法以HBV全基因组质粒为模板,扩增出目的区段:S(1～222AA)、preS1(10～50AA),以酶切-PCR的方法将其连接为ss1融合基因,然后克隆入表达载体pPIC3.5k;电穿孔转化毕赤酵母菌株GS115,筛选后进行诱导表达并对表达产物进行检测。结果表达产物的相对分子质量为30000左右,与抗HBs抗体和抗preS1抗体均有特异反应。结论ss1融合基因能够在P.pastoris酵母中高效表达,而且表达产物具有HBVS蛋白和preS1蛋白的抗原性,为进一步研究其免疫原性打下基础。     

乙型肝炎表面抗原对BALB/c小鼠细胞免疫应答的影响

目的研究不同来源乙肝表面抗原(HBsAg)对BALB/c小鼠的某些细胞免疫应答的影响.方法采用血源、CHO和酵母HBsAg分别免疫BALB/c小鼠,于免疫后不同时间制备脾脏单个核细胞(MNC),测定MNC对刀豆蛋白(ConA)和细菌脂多糖(LPS)的增殖反应性;采用绵羊红细胞(SRBC)作为致敏原,测定不同HBsAg免疫小鼠后迟发性超敏反应(DTH)的发生程度.结果不同来源HBsAg对ConA或LPS刺激的反应指数(SI)表现出不同的时间曲线,一般于免疫20?d和25?d时显著升高,其中血源HBsAg较高,酵母较低.H.M.-HBsAg在免疫5?d时即显出较高的SI值.CHO-HBsAg对SRBC诱导的DTH反应具有显著的抑制作用(P＜0.05).结论不同来源HBsAg诱导细胞免疫反应的类型和程度存在差异,CHO细胞来源的HBsAg对TH1细胞介导的DTH反应有抑制作用.     

不同来源乙肝表面抗原的细胞免疫学对比研究

目的　研究不同来源乙肝表面抗原诱导CD8 抗原特异性的细胞毒T淋巴细胞反应(CTL)的差异及T细胞产生细胞因子的能力 ,从而对各种来源乙型肝炎表面抗原 (HBsAg)的免疫原性有更充分的评价。方法　不同来源HBsAg分别免疫BALB c小鼠 ,于免疫后不同时间制备脾脏单个核细胞 (MNC) ,再以相应的HBsAg体外刺激 ,酶联免疫方法 (ELISA)测定细胞因子分泌水平 ;以Na2 5 1CrO4标记靶细胞 ,测定CTL反应活性 ;应用流式细胞仪分析T细胞亚群。结果　HM HBsAg免疫小鼠 10d后的脾细胞产生IFN γ水平最高 ,而在免疫后 2 0d和 2 5d ,IL 2的水平显著高于其它各组 ,CD3 分子脾淋巴细胞显著高于其它各实验组 (P <0 .0 5) ;plasma HBsAg免疫小鼠的脾淋巴细胞产生IFN γ和IL 2水平较低 ,但在免疫 2 5d对P815 HBs的杀伤性最强 ;HM HBsAg和SSC HBsAg免疫后CD4 CD8- 脾淋巴细胞比例显著增高 (P <0 .0 5) ;CD4- CD8 细胞所占百分比各组间及与空白对照组间差异无显著性 (P >0 .0 5)。结论　不同来源HBsAg诱导的细胞免疫反应类型和程度不同     

戊型肝炎病毒Ⅳ型在300例急性肝炎中的感染比例

目的：调查戊型肝炎病毒（HEV）Ⅳ型在北京地区的急性散发性肝炎中的分布。方法：采用RT－nPCR的方法检测300例急性散发性肝炎患者中HEV RNA，并对阳性产物进行克隆测序，然后对其基因型进行分析。结果：在300例急性散发性肝炎患者中PCR阳性为25例，测序证实25例PCR阳性者中，24例为HEV的基因序列；其中9例为HEV I型，15例为HEVⅣ型，占HEV感染的62．5％（15／14）。结论：在北京地区的部分急性散发性肝炎中HEVⅣ感染占戊型肝炎的较大比例。