核酸快速检测系统在新型冠状病毒检测中的应用评价

目的:探讨核酸快速检测系统在新型冠状病毒(SARS-CoV-2)检测中的性能与应用评价。方法:收集北京市疾病预防控制中心和中日友好医院检验科2020年2至7月的临床样本,评价核酸快速检测系统对SARS-CoV-2检测的敏感度、特异度、抗干扰能力、精密度以及临床样本检测符合率。分析敏感度的评价通过检测浓度梯度稀释的SARS-CoV-2样本,每个样本重复检测20次;分析特异度的评价是使用该系统检测与SARS-CoV-2感染部位相同或症状相似的病原体或假病毒及人源DNA和RNA;抗干扰能力研究是通过检测具有潜在干扰物质的样本进行评价;精密度研究通过评价试剂批内及批间的检测差异;临床样本检测符合率研究使用该系统检测230例咽拭子样本和95例痰液样本,并与传统实时荧光定量PCR(RT-qPCR)结果及临床诊断结果比较。结果:核酸快速检测系统对SARS-CoV-2核酸检测的分析敏感度为400拷贝/ml;核酸快速检测系统对感染部位相同或感染症状相似的病原体和人源核酸的检测结果均为阴性,分析特异度表明该系统与相关病原体及人源核酸无交叉反应;精密度表明批内/批间试验的高、中、低浓度样本的Ct值变异系数为1.90%~3.92%,均小于5%;加入潜在干扰物质后样本检测结果仍为阳性,说明样本中可能存在的干扰物质对检测结果无影响;与RT-qPCR结果及临床诊断结果符合率分别为98.46%和97.85%。结论:基于分子并行反应的核酸快速检测系统可作为一种快速检测SARS-CoV-2的选择方法。     

胰腺或胰岛移植防止或逆转糖尿病血管病变的研究进展

糖尿病已成为世界上发病率最高、对人类健康威胁最为严重的疾病之一.近年来,糖尿病的发病率不断上升,而且发病更趋年轻化.因此,糖尿病的防治成为目前医学研究的热点.糖尿病患者由于胰岛素产生障碍或胰岛素不能完全发挥生理作用而引起糖代谢紊乱,导致大血管及微血管病变,进而引发一系列并发症(包括动脉粥样硬化、肢体缺血坏死、视网膜病变和肾功能衰竭).虽然采用胰岛素治疗在一定程度上能够改善患者糖代谢紊乱,然而这种方法并不能有效地防止或逆转糖尿病引起的血管病变及其并发症.     

糖基化终末产物诱导大鼠视网膜微血管内皮细胞表型和功能改变

目的 研究糖基化终末产物(AGEs)诱导大鼠视网膜微血管内皮细胞表型和功能的变化及相关机制.方法 SPF级雄性Wistar大鼠20只,7～8周龄,体重260～280 g,分离培养大鼠视网膜内皮细胞,采用免疫荧光染色、流式细胞术和体外形成毛细血管样网络结构的方法进行鉴定.视网膜内皮细胞在AGEs刺激后,用噻唑蓝(MTT)法分析细胞的增殖能力;用膜连蛋白V/碘化丙啶(Annexin V/PI)双染法检测细胞凋亡;采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和流式细胞术检测细胞AGEs受体、人蛋白激酶C(PKC)、细胞间黏附分子1(ICAM-1)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达变化.采用t检验进行统计学分析.结果 分离纯化的大鼠视网膜内皮细胞表达血管性血友病因子(vWF)并在人工基膜上形成毛细血管网络结构.AGEs以时间和剂量依赖的方式抑制大鼠视网膜内皮细胞增殖能力,在200 mg/L的AGEs组培养至第5天时细胞增殖能力低于对照组(t=8.9,P＜0.05),7 d和9 d时抑制作用更明显(t值分别为15.7和46.1,均P＜0.01).400 mg/L AGEs组在第3天开始出现细胞增殖减慢(t=12.5,P＜0.05),从第5天开始增殖速度明显低于对照组(t值分别为22.4、41.5和77.7,均P＜0.01).并且AGEs诱导视网膜内皮细胞凋亡.进一步分析发现AGEs上调了大鼠视网膜内皮细胞AGEs受体、PKC、ICAM-1和iNOS的mRNA表达(t值分别为91.8、9.22、16和42,均P＜0.01)和蛋白水平的表达(t值分别为20.2、12.3、7.7和13.9,均P＜0.01).结论 AGEs可能通过上调AGEs受体诱导大鼠视网膜微血管内皮细胞表型和功能的改变.     

胰岛移植的新疗效——防止和逆转糖尿病的血管病变

现今，糖尿病已成为世界上发病率最高、对人类健康威胁最为严重的疾病之一。糖尿病患者由于产生胰岛素障碍或胰岛素不能完全发挥生理作用而引起糖代谢紊乱，导致一系列血管病变及其并发症，如动脉粥样硬化、肢体缺血坏死、视网膜病变和肾功能衰竭。虽然采用胰岛素治疗在一定程度上能够纠正患者的糖代谢紊乱，     

噬菌体生物扩增法测定痰标本结核分枝杆菌利福平耐药性

目的建立快速测定痰标本中结核分枝杆菌利福平（RFP）耐药性的噬菌体生物扩增法，探讨其在临床应用的可行性。方法噬菌体生物扩增法测定362份涂阳痰标本结核分枝杆菌对RFP的耐药性，并与罗氏绝对浓度法结果进行比较，对不符合的样本，用基因芯片的方法分析rpoB基因的突变情况。结果362份涂阳痰标本，培养阳性360份，菌种初步鉴定有17份样本为非结核分枝杆菌，噬菌体生物扩增法RFP耐药为123份，敏感的196份，两法结果一致的为88．6％，如以绝对浓度法药敏结果为标准，则噬菌体生物扩增法测定利福平耐药的敏感性为93-3％，特异性为87．9％，阴性预测值为96．4％，阳性预测值为78．9％，准确性为89．7％，涂阳等级（1＋～3＋）与实验的有效性相关。结论噬菌体生物扩增法测定痰标本利福平的耐药性只需2d，可作为快速筛诜方法府用千临床．     

人巨细胞病毒部分抗原基因的克隆及表达

目的克隆表达人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）特异性强的抗原决定簇基因，制备特异性抗原。方法从感染HCMV的细胞上清液中提取病毒基因组DNA，用PCR扩增HCMVpp150（ppUL32）、gp52（UL44）、pp65（ppUL83）、ppUL80a蛋白IgM抗原决定簇编码区DNA序列，将其克隆至pMD-18T载体并测序，然后克隆至表达载体pGEX-4T-1诱导表达，采用免疫印迹法（Western blotting）检测表达产物的抗原性。结果经序列测定各基因片段序列正确，并在pGEX-4T-1表达载体中得到了高效表达，表达的融合蛋白经Western blotting和ELISA分析，具有良好的抗原性，能够与HCMV IgM阳性血清发生特异性反应。结论通过基因工程技术可以有效地获取纯度较高、特异性强的HCMV抗原。为HCMV感染者的早期诊断提供检测用抗原。     

结核分枝杆菌耐利福平和异烟肼相关基因快速检测的应用研究

目的 利用DNA芯片检测技术直接检测痰标本中结核分枝杆菌耐利福平(RFP)、异烟肼(INH)相关的耐药基因(rpoB、katG/inhA),评价DNA芯片检测技术临床应用的可行性.方法 对586份涂阳痰标本使用L-J培养并用终点法确定其耐药性,同时利用DNA芯片检测技术检测痰标觋本中结核分枝杆菌的rpoB、katG/inhA常见基因突变位点的突变情况,比对两种方法的检测结果,对不符合的菌株测定其相应DNA序列,评估上述试验的准确性.结果 (1)586份涂阳痰标本,其中3(+)163份、2(+)204份、1(+)217份,培养阳性584份.耐药结果显示,对INH、RFP敏感的菌株分别为361株和327株,耐药菌株分别为223株和247株,其中低浓度耐药、高浓度敏感菌株分别为93株和59株,低浓度、高浓度均耐药菌株分别为130株和188株.(2)耐药基因特异性片段扩增阳性标本367份(62.8%)、阴性217份(37.2%).对INH耐药相关基因(katG/inhA)突变检出率是28.4%,突发发生位点集中在katG315位密码子(89.8%);对RFP耐药相关基因(rpoB)突变检出率是55.9%(137/247),突变发生位点主要在rpoB 531和rpoB 526位密码子,发生率分别是68.6%和16.1%.(3)对L-J药敏结果与DNA芯片检测结果不符的菌株进行DNA序列分析,发现有漏检现象.结论 DNA芯片技术直接检测样本中结核分枝杆菌的相关耐药基因存在可行性,如直接应用于临床样本检测,关键要解决样本中DNA的提取效率、PCR的扩增效率和试验的质量控制.     

C肽对GK大鼠糖尿病肾病的影响

目的研究C肽对糖尿病肾病GK大鼠肾脏病理和肾脏功能的影响及相关机制。方法SPF级自发性糖尿病GK大鼠,在糖尿病发病并且24小时尿蛋白超过300mg后,随机分为3组：C肽治疗组、空白对照组和胰岛素治疗组,每组8只,持续治疗12周。以同龄的正常Wistar大鼠作为正常组。治疗前及治疗后每4周检测各组大鼠血糖、24小时尿蛋白以及24小时尿白蛋白。治疗结束后,取各组大鼠肾脏,透射电子显微镜观察大鼠肾脏肾小球病理改变。采用实时定量PCR、westernblot以及免疫组织化学的方法检测肾小球RAGE、PKC－6和PKA的表达。采用单因素方差分析评价各组间的差异。结果与正常组相比,空白对照组的血糖、24小时尿蛋白和24小时尿白蛋白都明显升高：虽然C肽治疗组大鼠的血糖没有明显改变,但24小时尿蛋白和24小时尿白蛋白与空白对照组相比都明显减少;胰岛素治疗组的血糖明显降低,但24小时尿蛋白和24小时尿白蛋白与空白对照组相比没有明显差异。病理学检查显示,与空白对照组相比,C肽治疗组大鼠的肾小球硬化、肾小球系膜增生、基底膜厚度和足细胞的形态都明显改善,而胰岛素治疗不具有类似的作用。实时定量PCR、westernblot和免疫组织化学结果显示,C肽能够显著下调RAGE和PKC—β在糖尿病肾病大鼠肾小球的表达,并显著上调PKA的表达;而胰岛素仅能明显下调RAGE,对PKC、PKA的表达没有明显调节作用。结论C肽可能通过下调。肾小球毛细血管RAGE、PKC－β的表达和上调PKA的表达而改善GK大鼠的糖尿病肾病。     

胰高血糖素样肽-1保护内质网应激诱导的胰岛β细胞凋亡

目的探讨胰高血糖素样肽-1（GLP-1）对毒胡萝卜素（TG）诱导的胰岛13细胞凋亡的保护作用及可能机制。方法体外培养大鼠胰岛β细胞系-19细胞,采用TG诱导内质网应激,并比较存在GLP-1和GLP-1受体激动剂exendin-4的条件下胰岛B细胞凋亡情况。实验分为正常对照组、TG组（100nmol／L）、GLP-1（10nmol／L）＋TG（100nmol／L）组和exendin-4（100nmol／L）＋TG（100nmol／L）组,通过DNA片段化、原位转移酶缺口末端标记法（TUNEL）染色、AnnexinV—PI（膜连蛋白V／碘化丙啶）双染流式细胞仪检测4组细胞凋亡率的差异。采用Westernblot检测细胞色素c的释放。通过荧光探针DCFH—DA检测细胞活性氧簇（ROS）水平。罗丹明-R110（Z—DEVD—R110）染色检测细胞Caspase-3活性。2组间均数比较采用t检验,4组间比较采用单因素方差分析。结果DNA片段化检测和TUNEL染色实验均显示后两组细胞凋亡较TG组明显减少（F=2．16;t值分别为6．13和6．73,均P〈0．01）。AnnexinV—PI双染流式细胞仪检测显示TG组细胞的凋亡率为26％,在GLP-1和exendin-4存在的条件下,TG诱导的细胞凋亡明显减至19．7％和19．2％。进-步实验表明GLP-1和exendin-4能降低内质网应激过程中细胞色素c释放、活性氧簇ROS的产生和Caspase-3活性。细胞浆蛋白的Westernblot检测结果显示,给予GLP-1和exendin-4能降低内质网应激过程中细胞色素c释放（F=0．875;t值为5．37和7．26,P〈0．01）。细胞浆中凋亡蛋白酶Caspase-3的检测结果显示,GLP-1和exendin-4能抑制Caspase-3的激活和释放（F=0．838,t值为3．46和4．52,P〈0．01）。细胞线粒体活性氧的释放检测结果显示,正常情况下,细胞浆中可检测到-定量的活性氧,给予TG后释放的活性氧明显增多（61．67±7．64,t=22．13,P〈0．01）,给予GLP-1和exendin-4能减少活性氧的释放（32．3±3．21,t值分别为12．41和15．28,P〈0．01）。结论GLP-1对TG诱导的B细胞凋亡具有保护作用,其机制可能通过与内质网应激导致的细胞色素c释放、Caspase-3的激活和ROS的产生有关。     

噬菌体生物扩增法测定痰标本结核分枝杆菌利福平耐药性

目的建立快速测定痰标本中结核分枝杆菌利福平（RFP）耐药性的噬菌体生物扩增法，探讨其在临床应用的可行性。方法噬菌体生物扩增法测定362份涂阳痰标本结核分枝杆菌对RFP的耐药性，并与罗氏绝对浓度法结果进行比较，对不符合的样本，用基因芯片的方法分析rpoB基因的突变情况。结果362份涂阳痰标本，培养阳性360份，菌种初步鉴定有17份样本为非结核分枝杆菌，噬菌体生物扩增法RFP耐药为123份，敏感的196份，两法结果一致的为88．6％，如以绝对浓度法药敏结果为标准，则噬菌体生物扩增法测定利福平耐药的敏感性为93-3％，特异性为87．9％，阴性预测值为96．4％，阳性预测值为78．9％，准确性为89．7％，涂阳等级（1＋～3＋）与实验的有效性相关。结论噬菌体生物扩增法测定痰标本利福平的耐药性只需2d，可作为快速筛诜方法府用千临床．