胆固醇酯转移蛋白转基因家兔制作及生物学特性分析

摘要: 目的 制作肝脏特异性高表达人胆固醇酯转移蛋白（CETP）转基因家兔并对其生物学特性分析进行分析。方法 利用显微注射方法制作CETP转基因家兔,利用Western Blot、Real-time PCR和CETP活性鉴定试剂盒鉴定模型家兔中人CETP转基因的表达和活性。结果 PCR检验结果显示我们成功获得CETP转基因家兔,转基因主要在肝脏特异性表达,其血浆CETP活性相对于非转基因家兔明显升高。结论 本研究首次成功建立了高表达人CETP的转基因家兔,为研究CETP功能和其参与心血管疾病的机制提供了良好模型。     

长链非编码RNA EPB41L4A-AS1通过AKT调控子宫颈癌细胞的自噬水平

目的 探讨长链非编码RNA EPB41L4A-AS1通过AKT调控子宫颈癌细胞自噬的作用和机制。方法 运用小干扰RNA(siRNA)敲低子宫颈癌细胞HeLa中的EPB41L4A-AS1后,应用Western blot技术检测p62、LC3和AKT的蛋白表达水平,qRT-PCR检测AKT1和AKT2的mRNA表达水平。在GFP-LC3稳定过表达的HeLa细胞中转染siEPB41L4A-AS1,利用共聚焦扫描显微镜检测外源性LC3形成的自噬小体的变化。在HeLa细胞中转染siEPB41L4A-AS1,利用免疫荧光技术和荧光显微镜检测内源性LC3形成的自噬小体的变化。基因集富集(gene set enrichment analysis, GSEA)分析AKT和自噬通路在EPB41L4A-AS1高表达组和低表达组子宫颈癌患者中的富集情况。结果 与对照组相比,敲低EPB41L4A-AS1 48 h后HeLa细胞中p62表达水平显著下降(10%血清组：1.00±0 vs 0.39±0.17,无血清组：1.00±0 vs 0.55±0.14,P<0.05);LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ比值显著上升(...     

一种简单的gRNA体外筛选方法

目的探讨体外筛选效率较高的引导核糖核酸(guide ribonucleic acid,gRNA)的方法。方法以家兔扭转蛋白2A(torsin family 2 member A,TOR2A)基因的gRNA设计和筛选为例,介绍gRNA简单的体外筛选方法。首先根据TOR2A基因的外显子序列在线设计gRNA,选择3条gRNA序列(也可更多),将其分别插入到T7启动子之后,体外转录gRNA并纯化备用。设计包含gRNA打靶序列的一对引物,以基因组DNA为模板进行PCR扩增并胶回收PCR产物。将gRNA,PCR产物和Cas9内切酶组成的体系进行酶切实验,琼脂糖电泳判定gRNA引导的酶切效率。结果琼脂糖凝胶电泳结果显示第1条gRNA未能引导Cas9内切酶对含打靶位点的PCR产物进行DNA酶切,第2条gRNA(GCTTGTCCATCTCGTCGAAG)和第3条gRNA(TCTCTTCCTCTTCGACGAGA)引导Cas9进行了比较彻底的酶切,第2、3条gRNA可用于后续研究。结论此体外筛选方法是一种简单、可行和实用的gRNA的体外筛选策略。