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目的构建重组慢病毒表达载体pCDH-Daxx-EGFP,并探讨Daxx对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导VSMCs增殖的影响。方
法基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法构建重组慢病毒表达载体pCDH-Daxx-EGFP。经测序和酶切验证后,用重
组慢病毒表达载体pCDH-Daxx-EGFP与包装辅助载体共转染293T细胞进行慢病毒包装,收集病毒液纯化后感染VSMCs,
Western blot法鉴定过表达Daxx的VSMCs株。然后将pCDH-EGFP病毒液感染的空载体细胞和pCDH-Daxx-EGFP病毒液的
感染的过表达Daxx细胞都分成无血清培养基孵育组和AngⅡ孵育组。用MTT法检测细胞活性、流式细胞术观察细胞周期、划
痕法检测细胞迁移、Western blot法检测细胞中p-Akt蛋白表达。结果基因测序与双酶切鉴定表明Daxx基因慢病毒表达载体
构建成功;与Vector组比,转染Daxx组、蛋白表达水平明显增加(P<0.05);经AngII处理后,转染Daxx组细胞活性、S期细胞比率
和与细胞迁移率与Vector 组比较显著降低(P<0.05);转染Daxx组细胞中p-Akt 蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论成功构建
了重组慢病毒表达载体pCDH-Daxx-EGFP和过表达Daxx 的VSMCs株;Daxx能显著抑制AngII诱导的VSMCs增殖和迁移,
其机制可能与p-Akt蛋白有关。 相似文献
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目的利用网络药理学与分子生物学方法探究川续断皂苷乙(DB)的药理作用。 方法在ChemMapper数据库上预测DB的靶标,通过iGEMDOCK软件进行化合物与靶标蛋白对接,根据评分选出关键靶标蛋白,关键靶标蛋白通过STRING数据库构建蛋白之间的相互作用,GO富集分析与KEGG通路分析关键靶标蛋白调控蛋白网络的生物过程与通路。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖,通过MTT法与EdU法检测DB对VSMCs的细胞活性及增殖的影响。流式细胞术检测VSMCs周期,Western blot法与免疫荧光法检测关键靶标蛋白表达。 结果DB具有4个靶标蛋白,根据分子对接能量值选取DNA拓扑异构酶2a(TOP2a)后续研究对象,TOP2a相关的蛋白进行预测,得到相关蛋白10种,经过GO富集分析与KEGG通路分析,TOP2a可能参与VSMCs的增殖调控。MTT法结果显示DB对VSMCs活性明显抑制,具有剂量依赖性。EdU法检测DB(3、10、30 μmol/L)对VSMCs增殖有明显抑制作用。流式细胞术显示DB可能阻滞VSMCs的G1期向S期合成,进而影响细胞增殖。Western blot法结果显示DB下调蛋白TOP2a表达水平,同样免疫荧光法结果显示TOP2a表达下调。 结论DB可能通过下调TOP2a表达,调控细胞周期,抑制VSMCs的增殖。 相似文献
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