钙激活中性蛋白酶-2对整合素β4水解的影响

目的:观察乳腺癌细胞系MCF7细胞中,钙激活中性蛋白酶2(calpain-2)对整合素(integrin)β4水解的影响。方法:利用"短发夹"RNA(shRNA)和微小RNA(mirRNA)技术结合的calpain-2基因沉默(gene silencing)慢病毒质粒(GIPZ lentiviral shRNAmir)转染乳腺癌细胞株MCF7,嘌呤霉素筛选稳定沉默calpain-2基因的细胞株,细胞株传4代,用荧光显微镜观察转染效率,用蛋白质印迹(Western blot)实验检测calpain-2基因沉默效率及integrinβ4水解的情况。结果:嘌呤霉素筛选、细胞传4代,荧光显微镜下观察显示转染和筛选后,EGFP表达阳性的MCF7细胞的比例分别达到(95.6±2.6)%(空shRNAmir载体)、(97.1±1.7)%(Calpain-2 shRNAmir1)和(97.7±0.2)%(Calpain-2 shRNAmir 2),差异无统计学意义(P>0.05);Western blot结果显示,基因沉默的MCF7细胞中calpain-2的表达被明显抑制,相对于空shRNAmir载体转染的MCF7细胞,差异有统计学意义(P<0.01),calpain-2的表达下调到21.5%(Calpain-2 shRNAmir 1)和18.8%(Calpain-2 shRNAmir 2),空shRNAmir载体转染的MCF7细胞中calpain-2的表达与未转染的MCF7细胞比较,差异无统计学意义(P>0.05);比较calpain-2基因沉默和空shRNAmir载体转染的MCF7细胞,发现integrinβ4均被水解,水解片段的分子量主要有200 k D、130和95 k D;calpain-2基因沉默后,calpain-2基因沉默MCF7细胞中200 k D的水解片段比空shRNAmir载体转染的MCF7细胞减少(P<0.01)。结论:在乳腺癌细胞MCF7中,calpain-2可能参与integrinβ4的200 k D片段的形成,从而参与调整integrinβ4的构象变化。     

细胞培养密度对MCF7乳腺癌细胞integrin β4水解的影响

目的:研究细胞培养密度对MCF7乳腺癌细胞integrinβ4水解机制。方法:常规培养高密度和低密度MCF7乳腺癌细胞,分别给予钙离子螯合剂和肝素处理,用Western blot检测不同培养密度MCF7细胞integrinβ4的水解情况;用Fluo-3 AM作为钙离子荧光探针,激光共聚焦扫描显微镜检测细胞内钙离子的分布。结果:Western blot检测结果显示,在低密度和高密度培养的MCF7细胞中,integrinβ4的水解模式不同;在高浓度培养的细胞中,200 k D integrinβ4片段产生增多;激光共聚焦扫描显微镜观察发现,低密度培养MCF7细胞中,钙离子的绿色荧光主要成团或颗粒状分布,而且与红色荧光有较多的重合,部分钙离子分布于细胞核内;在高密度培养的细胞中,钙离子在细胞质膜和细胞核中的定位较少;钙离子螯合剂BAPTA-AM处理可使200 k D integrinβ4明显减少;10-6mol/L的肝素能够减少MCF7细胞200 k D水解片段的增多,随着肝素浓度的增高,抑制效果有所增强;相对于BAPTA-AM,10-4mol/L肝素的抑制效应减弱。结论:高密度培养的MCF7细胞中,钙离子从钙库中释放,细胞外内流增多,激活calpain 2,导致200 k D integrinβ4水解片段增多。     

雌二醇对三阴乳腺癌细胞integrin β4水解作用的影响

目的:研究三阴乳腺癌(TNBC)MDA-MB-231细胞中雌二醇对整合素(integrin)β4水解的促进作用。方法:常规培养MDA-MB-231细胞至指数增长期,分别给予17β-雌二醇、雌激素受体(ER)特异性阻断剂4-羟基他莫西芬(OHT)和G蛋白偶联受体30(GPR30)特异性阻断剂G-15干预30 min,采用蛋白质印迹(Western blot)实验检测钙激活中性蛋白酶2(calpain 2)的表达和integrinβ4水解的情况。结果:17β-estradiol在短时间内可促进MDA-MB-231细胞130和95k D integrinβ4水解片段的产生,促进作用呈浓度依赖方式,而对calpain 2表达没有明显影响;4-OHT不能阻断17β-estradiol对integrinβ4的水解作用,且其本身可促进integrinβ4水解;G-15能阻断17β-estradiol对integrinβ4的水解。结论:在TNBC MDA-MB-231细胞中,17β-estradiol可通过GPR30促进130和95k Dintegrinβ4水解片段的产生。     

细胞培养密度对MCF7细胞calpain2和FAK的水解及活性影响

目的：探讨细胞培养密度对乳腺癌MCF7细胞钙激活中性蛋白酶2（calpain 2）和焦点黏附蛋白（FAK）的水解及活性的影响.方法：常规培养乳腺癌细胞MCF7,分别以1×10^6、5×10^6、1×10^7个细胞传代于不同的6 cm皿中,培养36 h后,形成不同的培养密度（分别为低密度、正常密度和高密度）,裂解细胞,提取蛋白行Western blot检测calpain 2和FAK的表达,用磷酸化抗体检测FAK的Y397位点磷酸化水平;MCF7细胞高密度培养并calpain 2抑制剂处理后,用Western blot法检测FAK水解情况和磷酸化水平.结果：不同密度培养对calpain 2的表达没有明显影响,但可影响calpain 2的水解,培养密度加大,水解程度加强;培养密度也可以影响FAK的水解模式,低密度培养细胞的FAK以较大的水解片段为主,高密度培养的FAK则以较小片段为主,高密度培养细胞FAK Y397磷酸化水平比低密度的低;给予calpain 2特异性抑制剂后,高密度培养细胞FAK大片段增多,小片段减少,其Y397位点的磷酸化水平增高.结论：细胞高密度培养可使MCF7细胞calpain 2的活性增强,FAK的水解程度加大,降低FAK的磷酸化.