人GLIPR-2基因的克隆及在原核中可溶性表达

目的构建pQE80L-GLIPR-2载体,并检测融合蛋白RGS·His-GLIPR-2在原核中的表达水平。方法采用RTPCR方法,将克隆人GLIPR-2(glioma pathogenesis related-2,GLIPR-2)基因全长编码区的cDNA连接到原核表达载体pQE80L中,经IPTG诱导原核表达,通过Western blot检测融合蛋白RGS·His-GLIPR-2的表达水平。超声破壁后,通过SDS-PAGE电泳分析表达产物的表达形式。结果成功构建pQE80L-GLIPR-2载体;经IPTG的诱导,GLIPR-2可与RGS·His以融合蛋白的形式高效表达。经Western blot鉴定,pQE80L-GLIPR-2在原核内表达产物相对分子质量为18000,与预期融合蛋白大小一致。对表达产物可溶性分析表明,表达蛋白在上清液中和包涵体中均有表达。结论成功构建的重组质粒能够在大肠杆菌中高效表达可溶性目的蛋白,为进一步研究GLIPR-2基因的功能和意义奠定了基础。     

内皮细胞Jagged1下调促进PDGF诱导的大鼠平滑肌细胞增殖迁移

目的： 探讨内皮细胞Jagged1表达对PDGF诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖迁移的调节作用。方法: 分离培养大鼠主动脉内皮和平滑肌细胞,将内皮接种于下室、平滑肌接种于上室建立细胞共培养体系,根据内皮是否行Jagged1小RNA干扰分为对照组、空载体组和Jagged1小RNA干扰组。用Western blotting检测内皮细胞Jagged1的干扰效率。于下室加入PDGF（10 μg/L）干预24 h后分别用［3H］-TdR 掺入和平滑肌迁移计数检测平滑肌细胞增殖迁移能力,用Western blotting检测平滑肌细胞α-SM-actin蛋白表达。结果: 与对照组相比空载体组内皮细胞Jagged1蛋白表达无明显差异,Jagged1小RNA干扰组内皮细胞Jagged1蛋白吸光度相对值明显降低（0.26±0.02 vs 0.67±0.02, P<0.05）;PDGF+空载体组平滑肌［3H］-TdR 掺入量和迁移数与PDGF组相比无明显差异,PDGF+Jagged1小RNA干扰组平滑肌［3H］-TdR 掺入量和迁移数高于PDGF组{［3H］-TdR 掺入(23 074±2 702)counts·min-1·well-1 vs (16 442±1 803)counts·min-1·well-1,n=5,P<0.05;迁移(27±4)cells/field vs (15±3) cells/field, n=5,P<0.05};PDGF+空载体组平滑肌α-SM-actin蛋白表达与PDGF组相比无明显差异,PDGF+Jagged1小RNA干扰组平滑肌α-SM-actin吸光度相对值低于PDGF组（0.25±0.06 vs 0.49±0.04, n=3,P<0.05）。结论: 内皮细胞Jagged1下调促进PDGF诱导的平滑肌细胞增殖迁移,提示血管内皮细胞Jagged1表达在维持平滑肌收缩表型、抑制平滑肌过度增殖迁移中起一定调控作用。