三氧化二砷对Molt-4细胞株Notch信号通路作用机制的研究

目的 :探讨三氧化二砷(As2O3)对急性淋巴细胞白血病细胞株Molt-4中Notch1基因的作用机制。方法 :采用反转录(RT)-PCR检测正常人外周血淋巴细胞与急性淋巴细胞白血病细胞株A3和Molt-4中Notch1基因m RNA的相对表达量,选取Notch1 m RNA表达量较高的Molt-4细胞,分别经浓度0、2、4μmol/L As2O3处理细胞后,应用细胞计数试剂盒(CCK8)检测细胞活力,显微镜下观察细胞形态学变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率,RT-PCR检测Notch1 m RNA表达率,蛋白质印迹法检测细胞内Notch1、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)及胱天蛋白酶3(caspase-3)凋亡蛋白的表达情况。结果:As2O3能下调Molt-4细胞中Notch1基因及蛋白的表达,降低Bcl-2/Bax蛋白比例,并促进凋亡蛋白胱天蛋白酶3的活化,2μmol/L As2O3处理后,随作用时间延长,Molt-4细胞的凋亡率逐渐增高(r=0.989,P<0.05)。As2O3以时间和浓度依赖的方式诱导Molt-4细胞凋亡。结论:As2O3通过抑制Molt-4细胞株Notch1信号通路的表达,抑制其增殖并诱导凋亡。     

耐药调节剂对急性髓系白血病细胞株CYP3A5基因转录及蛋白表达影响

目的:探讨耐药调节剂对急性髓系白血病细胞株(急髓细胞株)细胞色素P450 3A亚家族多肽5(CYP3A5)转录及蛋白表达的影响及其与白血病耐药的关系。方法:采用RT-PCR和Western印迹法检测药物代谢酶CYP3A5转录和蛋白表达水平。结果:K562、U937细胞经环孢素作用24h后CYP3A5转录增强,维拉帕米则出现微弱的转录,作用48h后两者转录均减弱,与未加药细胞组相比差异有统计学意义(P<0.01);K562细胞经环孢素、维拉帕米作用24～48h后,蛋白表达均增加,与未加药细胞组相比差异有统计学意义(P<0.01);U937细胞蛋白表达与基因转录基本一致。结论:耐药调节剂可诱导急髓细胞株CYP3A5基因的转录和蛋白的表达。     

凋亡相关基因pnas-2的表达谱分析

为了确定凋亡相关基因pnas-2在正常组织及急性白血病患者组织中的表达谱，应用Northernblot检测了pnas-2在心脏、脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾脏、胰腺、脾脏、淋巴结、胸腺、白细胞、骨髓和胎肝等组织中的表达，应用实时PCR（real—timePCR）和Northernblot检测了该基因在急性白血病44份初发、9份未缓解、27份缓解、12份复发样本中的表达，并检测了pnas-2在31例恶性肿瘤患者癌组织及正常组织中的表达。结果表明，pnas-2基因除了在胎盘中表达外，在其他检测的组织中均无表达。pnas-2基因在初发，未CR和复发急性白血病患者中的表达显著高于CR和癌肿患者的癌组织及正常组织中的表达。在7例急性白血病患者的自身前后对照中，pnas-2的表达变化与病程演变有关，即初发时高表达，未CR时无明显改变，但在CR时显著下降，复发时表达又上升。结论：pnas-2的高表达在急性白血病中是特异的，可能是一种癌基因，并很可能参与了白血病的发病。     

DCK基因多态性与阿糖胞苷治疗急性髓系白血病疗效的关系

目的 研究脱氧胞苷激酶(DCK)的单核苷酸多态性(SNP)及其对阿糖胞苷(Ara-C)治疗急性髓系白血病(AML)疗效的影响.方法 采用高温连接酶检测反应技术,检测126例接受Ara-C治疗的AML患者(AML组)和100名健康人(正常对照组)DCK基因7个SNP位点(SNP1～7)的基因型和等位基因分布频率,比较DCK不同基因型分布AML组患者的Ara-C治疗效果.结果 DCK基因SNP1(rs2306744)等位基因和SNP2(rs12648166)基因型分布频率,在正常对照组与AML组和Ara-C治疗无效组(n=35)之间比较,差异均有统计学意义(P<0.05).在AML组,SNP1的CC型基因型和SNP2的多态性基因型(AG+GG型)以及SNP3(rs4694362)的野生型基因型,对Ara-C治疗表现出较好的临床反应.结论 DCK基因的SNP能作为潜在的Ara-C治疗AML患者预后的分子标志之一.     

DCK基因多态性与阿糖胞苷治疗急性髓系白血病疗效的关系

目的研究脱氧胞苷激酶（DCK）的单核苷酸多态性（SNP）及其对阿糖胞苷（Ara-C）治疗急性髓系白血病（AML）疗效的影响。方法采用高温连接酶检测反应技术,检测126例接受Ara-C治疗的AML患者（AML组）和100名健康人（正常对照组）DCK基因7个SNP位点（SNP1~7）的基因型和等位基因分布频率,比较DCK不同基因型分布AML组患者的Ara-C治疗效果。结果 DCK基因SNP1（rs2306744）等位基因和SNP2（rs12648166）基因型分布频率,在正常对照组与AML组和Ara-C治疗无效组（n=35）之间比较,差异均有统计学意义（P〈0.05）。在AML组,SNP1的CC型基因型和SNP2的多态性基因型（AG＋GG型）以及SNP3（rs4694362）的野生型基因型,对Ara-C治疗表现出较好的临床反应。结论 DCK基因的SNP能作为潜在的Ara-C治疗AML患者预后的分子标志之一。     

抗PNAS-2单链抗体对白血病U937细胞凋亡的影响

目的观察抗PNAS-2单链抗体与PNAS-2抗原特异性结合的能力,并在此基础上探究其对急性单核细胞白血病U937细胞凋亡的影响。方法运用反转录病毒转染法将抗PNAS-2单链抗体表达载体pMIG-PNAS-2ScFv转入U937细胞(pMIG-PNAS-2ScFv组),同时设转染pMIG空载体(NC组)及未转染载体的U937细胞(U937组)为对照。流式细胞仪检测转染效率;激光共聚焦显微镜观察单链抗体表达情况及与靶抗原特异性结合的能力;流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测细胞凋亡;Western blotting观察PNAS-2表达及促凋亡因子caspase-3激活情况。结果成功将抗PNAS-2单链抗体编码序列转入U937细胞,所表达的单链抗体能与PNAS-2抗原特异性结合。与NC组和U937组相比,pMIG-PNAS-2ScFv组细胞凋亡率明显上升(P<0.05),活化型caspase-3表达增加,但PNAS-2含量并无变化。结论抗PNAS-2单链抗体能有效结合U937细胞内的PNAS-2抗原并有促进U937细胞凋亡的作用,其促凋亡机制可能与PNAS-2功能位点被封闭后功能失活而无法发挥抑凋亡作用有关。     

糖皮质激素受体在白血病CYP3A5耐药中的信号转导作用

目的 探讨糖皮质激素受体在白血病CYP3A5耐药中的信号转导作用. 方法 采用DNA重组技术构建ptracer-hGR重组质粒,并用报告基因检测方法研究糖皮质激素受体对CYP3A5药物代谢酶转录、表达调控中的信号转导作用. 结果 菌落PCR及测序证实成功构建ptracer-hGR重组质粒.经阿糖胞苷、甲氨蝶呤和长春新碱三种化疗药物加药后共转染ptracer-hGR质粒的实验组荧光素酶相对活性显著高于单纯转染CYP3A5报告基因质粒的对照组,差异具有统计学意义(P=0.0362、0.0034和0.0164);而卡铂和米托蒽醌加药后,荧光素酶相对活性无明显增高趋势. 结论 阿糖胞苷、甲氨蝶呤和长春新碱三种化疗药物可能通过激活糖皮质激素受体这一信号途径而上调CYP3A5 mRNA的转录.     

RNA干扰PNAS-2后U937细胞周期及相关蛋白表达的变化

目的 研究RNA干扰抑制细胞凋亡相关蛋白(PNAS-2)基因表达后,急性单核细胞白血病细胞株U937细胞周期及其相关蛋白表达的变化.方法 将已构建的靶向抑制PNAS-2的干扰组质粒和对照组质粒分别转染U937细胞.流式细胞仪分析两组细胞周期的变化;蛋白质芯片技术比较两组细胞周期相关蛋白表达水平的差异.结果 流式细胞仪检测结果显示,干扰组细胞出现G2/M期阻滞,与对照组比较差异有统计学意义;蛋白质芯片结果分析发现,有29条细胞周期相关蛋白表达变化,其中上调25条(cyclinA、cyclinE及相关调节因子p53蛋白等),下调4条.CyelinB表达水平无显著改变.结论 RNA干扰抑制PNAS-2表达后,U937细胞周期出现G2/M期阻滞,可能与细胞周期素A、p53蛋白表达上调,而细胞周期素B表达不变有关.     

预激方案CAG治疗急性髓细胞白血病的疗效及作用机制

目的观察含粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的预激方案在治疗初治急性髓细胞白血病(AML)中的疗效,并进一步研究其作用机制。方法13例初治AML患者予以含G-CSF、低剂量阿糖胞苷(Ara-C)和阿克拉霉素(ACR)的CAG方案。以U937细胞株为体外实验模型,流式细胞仪检测细胞早期凋亡标记Annexin V以及进行细胞周期分析。结果一疗程完全缓解率为46.2%(6/13),部分缓解率为38.5%(5/13),总有效率84.7%(11/13);二疗程完全缓解率为76.9%(10/13)。体外实验中,经CAG处理后,早期凋亡标记Annexin V明显升高(P<0.01)。细胞周期检测显示,CAG处理24 h后,S期细胞比例明显升高(P<0.05)。结论G-CSF可增加化疗药物对AML的疗效,其作用机制主要是通过G-CSF促使G0期白血病细胞进入细胞增殖周期,增加细胞周期特异性化疗药物的细胞毒性,诱导细胞凋亡是主要途径。     

磷酸氯喹诱导U937细胞凋亡机制的研究

目的 将磷酸氯喹作用于白血病细胞株U937,观察其对白血病细胞凋亡的影响;并研究磷酸氯喹是否通过逆转凋亡相关基因PNAS-2蛋白在白血病细胞中异常的亚细胞定位,从而促进细胞凋亡的机制。方法 将不同剂量的磷酸氯喹加入体外培养至对数生长期的白血病细胞株U937培养液中。MTT法检测细胞增殖;流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测细胞凋亡,同时观察磷酸氯喹对U937细胞中PNAS-2蛋白亚细胞定位的影响。结果 50 μg /mL磷酸氯喹可显著促进U937细胞发生凋亡,并使白血病细胞中PNAS-2蛋白的异常亚细胞定位发生改变。结论 磷酸氯喹对白血病细胞株U937有促进凋亡的作用,其凋亡机制可能是使PNAS-2蛋白在白血病细胞中异常的亚细胞定位恢复正常,对于临床治疗白血病的具有潜在的应用价值。