人可溶性TNF受体Ⅱ克隆、原核表达与活性鉴定

目的构建人可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ（sTNFRⅡ）原核基因表达载体，并在大肠埃希菌中高效表达之。方法采用RTPCR技术．从人外周血的单核细胞中扩增出肿瘤坏死因子受体Ⅱ（TNFRⅡ）基因的胞外区，将其克隆入pET28a（＋）高效表达载体进行诱导表达．并对表达产物进行纯化及鉴定。结果在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导下．转入外源基因的大肠埃希菌BL21（DE3）可高效表达sTNFRⅡ蛋白．SDS-PAGE显示在32kD处有一特异表达条带．其表达量占菌体蛋白总量的30％左右。纯化的sTNFRⅡ经Western blot鉴定具有生物学活性；生物活性实验（MTT法）显示它可有效地封闭分泌性肿瘤坏死因子α（sTNF-α）对L929细胞的胞毒效应；直接免疫荧光显示它町以特肄性抑制GFP-sTNF-α与靶细胞肿瘤坏死因子受体的结合。结论通过基因工程技术获得了人sTNFRⅡ的重组蛋白。     

跨膜型TNF-a突变体(△-28)的正向和反向信号对U937细胞的作用

目的 观察跨膜段突变TM-TNF-a(△-28mTM-TNF-a)正反向信号诱导U937促炎因子表达的影响.方法 △-28mTM-TNF-a质粒分别转染COS-7,检测表达的△-28mTM-TNF-a诱导U937产生N0的量.同样△-28mTM-TNF-a质粒转染U937,sTNFRI激活反向信号后,检测U937促炎因子IL-8以及IL-1β的mRNA转录水平.结果 △-28mTM-TNF-a不能够诱导U937产生NO,但被激活并传递反向信号促使U937的促炎因子转录和表达.结论 跨膜段突变抑制了TM-TNF-a正向信号但不影响反向信号的传递.     

跨膜型TNF-α突变体（△-28）的正向和反向信号对U937细胞的作用

目的观察跨膜段突变TM-INF-α（△-28mTM-TNF-α）正反向信号诱导U937促炎因子表达的影响。方法△-28mTM-TNF-α质粒分别转染COS-7，检测表达的△-28mTM-TNF-α诱导U937产生NO的量。同样△-28mTM-TNF-α质粒转染U937，sTNFRI激活反向信号后，检测U937促炎因子IL-8以及IL-1β的mRNA转录水平。结果△-28mTM-TNF-α不能够诱导U937产生NO，但被激活并传递反向信号促使U937的促炎因子转录和表达。结论跨膜段突变抑制了TM-TNF-α正向信号但不影响反向信号的传递。     

人可溶性TNF受体Ⅱ克隆﹑原核表达与活性鉴定

目的构建人可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ(sTNFRⅡ)原核基因表达载体,并在大肠埃希菌中高效表达之.方法采用RT-PCR技术,从人外周血的单核细胞中扩增出肿瘤坏死因子受体Ⅱ(TNFRⅡ)基因的胞外区,将其克隆入pET28a(+)高效表达载体进行诱导表达,并对表达产物进行纯化及鉴定.结果在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下,转入外源基因的大肠埃希菌BL21(DE3)可高效表达sTNFRⅡ蛋白,SDS-PAGE显示在32 kD处有一特异表达条带,其表达量占菌体蛋白总量的30%左右.纯化的sTNFRⅡ经Western blot鉴定具有生物学活性;生物活性实验(MTT法)显示它可有效地封闭分泌性肿瘤坏死因子α(sTNF-α)对L929细胞的胞毒效应;直接免疫荧光显示它可以特异性抑制GFP-sTNF-α与靶细胞肿瘤坏死因子受体的结合.结论通过基因工程技术获得了人sTNFRⅡ的重组蛋白.