冻存复苏条件对髓性白血病细胞株生物学特性的影响

目的:采用不同方法对白血病HL60细胞株进行冻存和复苏,观察生物学特性改变,筛选最佳冻存复苏方案。方法:实验于2006-04/06在吉林医药学院临床检验实验室(国家三级标准)进行。①HL60细胞株由中国科学院上海生物细胞研究所提供。将欲冷冻保存的HL60细胞调整到良好的生长状态(对数生长期),随机数字表法分成4组,离心收集后在含体积分数为0.1小牛血清的RPMI-1640培养基中分别加入二甲基亚砜,使其终浓度依次为50,100,150,200g/L。冻存15d后,每组取1支冻存管复苏并接种于细胞培养板,培养12h后用锥虫蓝拒染法计算细胞复苏率。②选择冻存条件和冻存细胞密度相同的两支冻存管,按不同方法进行HL60细胞复苏。37℃水浴传统复苏法:立即将冻存管置于37℃水浴中,待融化后800r/min离心5min,吸去上清液,加入含体积分数为0.1小牛血清的RPMI-1640培养基,混匀后接种于细胞培养板,1mL/孔,9孔/组,置于体积分数为0.05的CO2培养箱37℃继续培养。40℃溶解后再37℃恒温改良复苏法:将冻存细胞于40℃水浴中迅速溶解,转入37℃水浴箱,融化后离心、加培养基等操作同传统复苏法。复苏细胞培养12h后采用锥虫蓝染色计算细胞存活率。③用无血清RPMI-1640培养基制备HL60细胞悬液,按3×107L-1密度接种于细胞培养板中,1mL/孔,然后分别加入体积分数为0.05,0.1,0.12,0.15,0.2的灭活小牛血清,每种血清浓度设置8个试验孔,并分别于培养12,24,36,48,60,72,84,96h后计数每孔细胞数量,并绘制细胞生长曲线。结果:①不同浓度二甲基亚砜冻存后HL60细胞复苏率的比较:二甲基亚砜200g/L组的细胞复苏率明显低于二甲基亚砜50,100,150g/L组[(64.6±2.8)%,(87.0±1.4)%,(86.4±2.1)%,(85.7±2.8)%;t=25.44,P<0.01],二甲基亚砜50,100,150g/L组间差异无显著性意义(t=0.82～1.44,P>0.05)。②不同复苏方法HL60细胞存活率的比较:与37℃水浴传统复苏法比较,40℃溶解后再37℃恒温改良复苏法的细胞存活率显著升高[(69.5±1.5)%,(87.4±1.8)%,t=23.24,P<0.01]。③RPMI-1640培养基不同血清含量对HL60细胞生长情况的影响:在体积分数为0.05的血清含量培养基中,HL60细胞基本不生长,且有逐渐死亡的趋势;在体积分数为0.1的血清含量培养基中,HL60细胞生长趋势明显,但生长速度相对较慢;在体积分数为0.12,0.15,0.2的血清含量培养基中,HL60细胞生长迅速,3种血清浓度间细胞生长趋势无明显差异。结论:以50g/L二甲基亚砜作为HL60细胞冻存保护剂、联合40℃溶解后再37℃恒温改良复苏法可使细胞保持最佳生物学特性,体积分数为0.12的血清含量为HL60细胞常规培养的最适浓度。     

人参皂甙单体Rh2诱导髓性白血病细胞株凋亡的时效与量效★

目的：已发现人参中某些有效组分能增强和激活机体免疫系统，具有抗肿瘤、抗衰老、抗辐射等多种生物活性作用。选取人髓性白血病细胞株HL60为模型，探讨人参皂甙单体Rh2抑制其增殖和诱导凋亡的时效量效关系。 方法：实验于2006-07/08在吉林医药学院临床检验实验室进行。①材料：人参皂甙单体Rh2购自吉林省宏久生物科技股份有限公司，批号050801，溶于pH 7.4磷酸盐缓冲液中配成50 g/L母液。人髓性白血病细胞株HL60购自中国科学院上海生物细胞研究所。②实验方法：取处于对数生长期的HL60细胞制备3×108 L-1细胞悬液，接种后6 h分别加入终浓度为5，10，20，40，80 mg/L的人参皂甙单体Rh2 100 μL，于加药48 h后采用MTT比色法检测人参皂甙单体Rh2对HL60细胞生长的抑制作用，计算抑制率和半数抑制浓度。选择半数抑制浓度的人参皂甙单体Rh2处理HL60细胞，分别于作用6，12，24，48，72 h后采用MTT比色法测定抑制率，并与未加药对照组进行比较。半数抑制浓度的人参皂甙单体Rh2作用48 h时倒置显微镜下观察HL60细胞形态，吉姆萨染色观察细胞凋亡情况。 结果：①量效关系：人参皂甙单体Rh2浓度为5，10，20，40 mg/L时，处理48 h后HL60细胞生长抑制率呈升高趋势（F=9.45，P < 0.01），具有明显的剂量依赖性；至80 mg/L时抑制率与40 mg/L基本相似。加药48 h后半数抑制浓度为13.0 mg/L。②时效关系：13.0 mg/L人参皂甙单体Rh2处理HL60细胞6，12，24，48，72 h后，抑制率逐渐升高（F=9.32，P < 0. 01），呈时间依赖性。③HL60细胞形态观察：与未加药对照组比较，经13.0 mg/L人参皂甙单体Rh2处理后HL60细胞数量明显减少，细胞分散，体积缩小，细胞核呈碎片状。④凋亡细胞吉姆萨染色检测：经13.0 mg/L人参皂甙单体Rh2处理后，HL60细胞出现核染色质浓缩、呈周边凝聚，核膜裂解形成凋亡小体、胞质出现空泡但胞膜完整的典型细胞凋亡形态学改变。 结论：人参皂甙单体Rh2能有效抑制体外培养HL60细胞的增殖，并诱导其凋亡，干预效果呈时间和剂量依赖。     

应用多种教学手段提高骨髓细胞形态学的教学效果

《血液学及血液学检验》是医学检验专业学生的主干课程之一,其中骨髓细胞形态学是教学中的重点和难点,以往由于教学手段落后,且实验课所需的教学片因时间长久而褪色,故教学效果不够理想。近年来,我们通过改善教学条件,运用直观教学法、启发教     

山茱萸总皂苷的提取分离与含量测定

目的：考察不同提取方法对山茱萸总皂苷测定的影响，为准确测定山茱萸皂苷的含量提供可行方法。方法：（1）甲醇回流法；（2）乙醚脱脂－甲醇回流提取法；（3）超声法；（4）大孔树脂法；（5）乙醇回流法。上述方法分别用人参皂苷Re、齐墩果酸作对照，比色法测定不同提取液中总皂苷的含量；结果：（1），（2），（3）和（5）提取法所测总皂苷含量为5．95％，6．98％，2．87％，3．12％；3．80％，3．92％，6．17％和8．13％。（4）法测定总皂苷含量为1．52％和1．73％。结论：不同提取方法对山茱萸总皂苷含量的测定有较大的影响。     

大孔吸附树脂法分离纯化山茱萸总皂苷

目的 :研究并优化大孔树脂法分离纯化山茱萸总皂苷 .方法 :70 0mL·L-1乙醇提取后 ,上HPD 3 0 0型大孔吸附树脂 ,水洗后分别用 3 0 0mL·L-1,5 0 0mL·L-1,70 0mL·L-1乙醇洗脱 ,考察大孔树脂富集、纯化山茱萸总皂苷的吸附性能和洗脱参数 ,并与常规溶剂提取法相对照 .结果 :山茱萸总皂苷富集于 5 0 0mL·L-1乙醇洗脱液部分 ,洗脱剂用量为上柱样品液的 8倍 ,洗脱率达 81 8% .大孔树脂法与常规溶剂法提取山茱萸总皂苷的得率分别为 2 4 9% ,2 19% .结论 :采用大孔吸附树脂可较好地纯化山茱萸总皂苷     

尿毒症血液透析患者血浆抗氧化能力的测定

目的 探讨尿毒症血液透析患者透析前后的血浆抗氧化能力变化的临床意义.方法 将113例尿毒症血液透析患者进行透析前后血液氧化与抗氧化能力测定,并与正常对照组进行比较.结果 尿毒症患者血液超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、一氧化氮(NO)与对照组比较均有不同程度下降,而丙二醛(MDA)明显增高,并有显著性差异(P＜0.001).血液透析后SOD、GSH-PX、NO与透析前比较下降,MDA增高,显著性差异(P＜0.001).结论 尿毒症患者血液中抗氧化能力下降,而活性氧增强;血液透析时氧化应激状态增强,对减少血液透析治疗的副作用、延长尿毒症患者的生存期有重要意义.     

高效液相色谱法测定魔芋精粉中葡甘露聚糖的含量及其单糖组成

目的:建立魔芋精粉中葡甘露聚糖(Konjac glucomannan,KGM)的含量及其单糖组成分析的测定方法。方法:还原单糖用1-苯基-3-甲基-5-吡啉唑酮衍生化后采用反相高效液相色谱法,分段梯度洗脱,检测波长250 nm。通过内标法和外标法的结合对2种单糖的定量进行了方法学研究,同时测定了魔芋精粉中KGM含量。结果:该方法甘露糖在1.001～8.008nmoL线性关系良好(r=0.9994);葡萄糖在1.002～8.016nmoL线性关系良好(r=0.9990),KGM平均回收率为98.1％,相对标准偏差为1.84％,重现性为1.72％,KGM含量为79.5％,其单糖组成为Glc:Man=1:1.51。结论:此方法简便、快速,可同时测定KGM含量及其单糖组成,便于魔芋精粉的质量评价。     

检测Ⅳ型胶原蛋白直接双抗夹心法的建立与评价

目的 :建立血清 型胶原蛋白 (COL - )浓度测定的直接双抗夹心法 ,为临床诊断肝纤维化提供一种新的指标。方法 :采用本科室自制的 COL - 单克隆酶标抗体、多克隆抗体建立的直接双抗夹心法 ,同时采用日本试剂盒测定 6 0份正常和肝脏病人血清 COL- 浓度做对照比较。结果 :两种方法无显著性差异 (P>0 .0 5 ,t=0 .16 6 ) ;两法相关分析 ,γ=0 .834,回归方程为 Y=0 .5 9X+ 70 .874。结论 :直接双抗夹心法测定血清 COL- 操作简便、特异、准确 ,可作为辅助诊断肝纤维化的可靠指标 ,并可在临床推广应用     

妊娠妇女血清总胆汁酸及肝功能的检测

目的探讨孕妇血清总胆汁酸(TBA)水平变化规律,以减少妊娠并发症,保证胎儿正常发育。方法采用日立7150型全自动生化分析仪对322例不同孕期的妇女及非孕妇女进行血清TBA及常规肝功能项目对照检查。结果孕妇血清TBA、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(TBIL)、总蛋白(TP)及白蛋白(ALB)与对照组比较有差异性,但大多数仍在正常范围内;妊娠期肝内胆汁瘀积症(ICP)及中高度妊高征孕妇血清TBA显著增高。结论孕妇血清TBA随妊娠时间增加而升高,它是ICP及妊高征肝损害早期诊断的一个敏感指标,因此孕妇血清RBA测定应作为一个常规检测项目。