TAT-ASPP2融合蛋白的制备及其对胶质瘤细胞增殖的抑制作用

目的:制备TAT-ASPP2融合蛋白,探讨其对人胶质瘤U-87MG细胞和U251细胞增殖的抑制作用。方法:设计TAT-ASPP2引物,应用IN-Fusion技术构建原核表达质粒pET-TAT-ASPP2,双酶切、DNA测序鉴定后转化大肠杆菌E.coliBL21,IPTG诱导TAT-ASPP2融合蛋白的表达,SDS-PAGE和Western blotting鉴定TAT-ASPP2融合蛋白。MTT法检测TAT-AS-PP2融合蛋白对U-87MG和U251细胞增殖的作用。结果:成功构建了原核表达质粒pET-TAT-ASPP2,转化E.coli BL21后成功表达TAT-ASPP2融合蛋白,其相对分子质量约为128000,并可被ASPP2特异性抗体所识别。TAT-ASPP2融合蛋白对U-87MG和U251细胞增殖的抑制率分别为(65.0±3.0)%和(64.7±2.5)%,而ASPP2蛋白则不能抑制U-87MG和U251细胞的增殖。结论:成功地克隆、表达及纯化TAT-ASPP2融合蛋白,该融合蛋白可抑制胶质瘤细胞的增殖。     

GST-TAT-GFP融合蛋白的表达、纯化及鉴定

目的 获得融合TAT短肽的融合蛋白GST—TAT-GFP，以用于阐明TAT短肽的跨膜递送机理。方法 以质粒pGEX—GFP为模板，扩增目的基因TAT—GFP，将其克隆至质粒pGEX-2T，用所构建的质粒pGEX—TAT—GFP转化大肠杆菌BL21并诱导表达，利用GS-4B亲和柱进行纯化，所得产物进行SDS-PAGE、Western blot及细胞跨膜实验鉴定。结果 大肠杆菌细胞经诱导高效表达出约54．3kD的蛋白，其相对分子质量与GST—TAT-GFP融合蛋白相符；Western blot显示该融合蛋白能够被抗GFP的抗体特异性识别；细胞实验表明融合TAT短肽的融合蛋白能跨膜进入细胞L-02、SMMC-7721、Hela和BEL-7402。结论 在大肠杆菌表达系统中高效表达了有活性的GST—TAT—GFP融合蛋白。     

TAT蛋白转导结构域介导融合蛋白在小鼠活体的跨膜递送作用

目的 探讨跨膜递送短肽--TAT蛋白转导结构域(简称TAT)介导的与其融合的活性蛋白在活体的跨膜递送作用.方法 以融合蛋白GST-TAT-GFP,GST-GFP-TAT和GST-GFP为研究模型蛋白,不经过蛋白质的变性处理、直接通过向小鼠腹腔注射和皮肤涂抹这两种含TAT的融合蛋白及作为对照的融合蛋白GST-GFP,一定时间作用后取体内器官和皮肤做冷冻切片,荧光显微镜检测这些融合蛋白的跨膜递送情况;并对分别融合在C端或者N端的TAT介导GFP在活体动物体内和皮肤的跨膜递送作用进行对比.结果 腹腔注射实验结果表明,TAT可以介导不经过蛋白质的变性处理的融合蛋白GST-TAT-GFP和GST-GFP-TAT跨膜递送进入到小鼠的心脏、肝、肾、脾和肺,甚至脑组织;其中GST-GFP-TAT跨膜递送效率比GST-TAT-GFP更高.结构模拟分析提示GST-GFP-TAT与GST-TAT-GFP中的TAT的暴露情况不同可能是造成两种蛋白跨膜递送活性差异的重要因素.皮肤实验的结果则表明TAT不仅介导融合蛋白GST-TAT-GFP和GST-GFP-TAT进入小鼠表皮,而且使其进入小鼠皮肤的真皮层.结论 TAT可以跨膜递送不经过变性处理的融合蛋白进入小鼠皮肤和体内,递送效率可能与TAT的暴露程度相关;这些结果为在蛋白质疗法方面应用TAT提供了进一步的理论依据.     

SOD特性改善技术研究进展

超氧化物歧化酶（SOD）的发现。为氧代谢的研究开创了新的局面。氧自由基被认为是机体重要的信号分子,参与了多种信号途径,与多种疾病的发生发展相关。SOD作为机体最重要的抗氧化酶体之一,直接清除机体产生的超氧自由基,阻止了机体的过氧化。但自然存在的SOD在体内代谢快。且分子量大,不易透过细胞膜而进入靶细胞,限制了其在机体内的应用。针对天然SOD的不足,早期国内外学者通过化学方法对其进行修饰研究,得到了多种修饰酶,为其在多领域的应用奠定了基础。近年来也有不少学者利用固定化酶技术、基因工程等手段对其进行特性改造。使其跨膜性、靶向性大大提升。成果显著。本文试图对国内外超氧化物歧化酶功能特性改善技术的研究进行概括。     

经皮给药促透方法的研究进展

目的由于皮肤的屏障作用,经皮给药系统的应用受到限制,促透方法的研究成为焦点。许多方法可用于促进药物的经皮吸收。本文主要从化学法、物理法、药剂学法、生物法及促透方法的综合应用等方面阐述了近年来国内外在经皮给药促透方法的研究上所取得的进展。     

放射抗拒鼻咽癌细胞中Annexin A2相互作用蛋白的研究

 目的 筛选放射抗拒鼻咽癌细胞中Annexin A2的相互作用蛋白,以探讨Annexin A2在鼻咽癌放射抗拒中的作用机制。方法 采用免疫共沉淀结合质谱（MALDI-TOF/TOF）技术筛选并鉴定放射抗拒鼻咽癌细胞CNE-2（R743）中Annexin A2相互作用蛋白,用Mascot软件在NCBInr数据库对质谱数据进行检索,生物信息学分析Annexin A2及其相互作用蛋白在放射抗拒鼻咽癌细胞中的作用。结果 有5种蛋白与Annexin A2存在相互作用,分别是Calnexin、HSP90、GRP78、Vimentin、HSP27。将这些蛋白与Annexin A2进行生物信息学分析发现HSP90、GRP78和HSP27与Annexin A2存在直接相互作用,Calnexin、Vimentin与Annexin A2存在间接作用。结论 这些蛋白可能与Annexin A2存在相互作用从而导致鼻咽癌细胞的放射抗拒。