仿刺参水溶性海参皂苷的分离纯化及其抑瘤活性研究

为了获得具有显著抑瘤活性的水溶性海参皂苷样品, 利用大孔树脂柱、硅胶柱和葡聚糖凝胶柱对水溶性海参皂苷进行了分离纯化, 并对其体内外抑瘤活性和诱导肿瘤细胞凋亡进行了检测。研究结果显示, 大孔树脂柱的70%乙醇洗脱组分以及硅胶柱色谱的部分纯化组分 (pSC-2和pSC-3) 对HeLa细胞、A-549肺癌细胞、SGC-7901胃癌细胞和Bel-7402肝癌细胞均具有显著的抑瘤活性; 经过葡聚糖凝胶柱色谱, 获得了纯度均在99.6%以上、具有三萜类皂苷性质的SC-2和SC-3纯化样品, 发现SC-2纯化样品不仅能浓度和时间依赖性地抑制HeLa细胞的体外增殖, 还能剂量依赖性地抑制S180实体瘤的体内生长, 提高荷瘤小鼠的胸腺指数和脾指数。细胞凋亡检测结果显示, SC-2纯化样品可剂量依赖性地诱导HeLa细胞凋亡, SC-2纯化样品 (10和50 mg·L^-1) 处理12 h的HeLa细胞均出现了DNA片段化。可见, 水溶性海参皂苷SC-2纯化样品具有显著的抑瘤活性, 其机制可能是通过诱导肿瘤细胞发生凋亡来实现的。     

组织工程脱细胞角膜基质联合干细胞诱导分化制备异体角膜移植材料研究

目的研究脱细胞角膜基质联合干细胞制备异体角膜移植材料的安全性和有效性。方法应用酶-深低温法对猪角膜基质进行处理,制备猪脱细胞角膜基质。采用微注射法注入骨髓间充质干细胞进行共培养,制备异体角膜移植材料,并将其植于角膜病变的新西兰大白兔,评价术后组织工程角膜的系统性功能。结果脱细胞角膜基质的显微结构显示板层结构完整,未见细胞残留。共培养后光镜观察角膜基质细胞可于脱细胞角膜基质内生长,细胞形态具有纤维细胞特征,但分布不够均匀。移植术后,组织工程角膜愈合良好,未见明显的炎症及排斥反应。结论脱细胞角膜基质联合干细胞诱导分化制备异体角膜移植材料具有免疫排斥率低,组织相容性佳的特性。     

转化生长因子-β2体外抑制人角膜内皮细胞增殖的作用

目的:研究转化生长因子TGF-β2对体外培养人角膜内皮细胞(HCEC)增殖的影响机制。方法:体外培养经血清饥饿法获得同步化的HCEC,用不同浓度TGF-β2对HCEC进行不同时间的处理,采用细胞计数、MTT染色以及流式细胞仪(FCM)和RealtimePCR检测TGF-β2对HCEC的增殖、细胞周期及细胞中p27kip1和p21cip1表达的影响。结果:TGF-β21～15μg/L对HCEC有显著的增殖抑制作用,具有浓度和时间依赖性,9μg/L是TGF-β2抑制HCEC细胞增殖的峰浓度。9μg/LTGF-β2处理后,处于G1/G0期HCEC数量显著增加,并具有时间依赖性。9μg/LTGF-β2处理24h后,p27kip1表达量显著增加,48h后p27kip1和p21cip1的表达量均显著增加,也具有时间依赖性。结论:TGF-β2对HCEC具有显著的浓度和时间依赖性增殖抑制作用,可能通过先后诱导p27kip1和p21cip1表达量的增加将细胞拘留在G1/G0期来实现的。     

组织工程人角膜上皮体外重建的研究进展

从种子细胞的来源和载体支架的筛选两个方面对组织工程人角膜上皮的体外重建及其研究中所存在的问题与解决途径进行综述。     

哺乳动物诱导多功能干细胞（iPSc）的技术研究进展

诱导型多能干细胞（iPSc）具备胚胎干细胞的分化潜能,同时又回避了伦理问题,因此具有广泛且重要的临床应用价值。然而,目前iPS技术仍然存在致癌性、效率低等一系列问题。针对这些亟待解决的问题,本文综述了最近几年国内外在iPS细胞研究领域中的发展现状及研究方法,并探讨该领域中急需解决的问题和发展前景,以为诱导性多功能干细胞的研究提供一定的借鉴。     

角膜上皮细胞体外培养技术的研究进展

体外重建组织工程角膜并将其用于角膜移植是使角膜盲患者复明的惟一有效途径,其中角膜上皮种子细胞的来源成为急需解决的关键问题。由于体外生长的角膜上皮细胞生命周期短,因此通过改进体外培养技术来获得增殖能力强的细胞成为解决角膜上皮种子细胞来源问题的首要任务。本研究从角膜上皮细胞的体外培养技术包括培养方法和培养条件这两方面进行了综述。     

盐酸奥布卡因对人角膜内皮细胞影响作用的实验研究

目的：揭示眼科局部麻醉剂盐酸奥布卡因（oxybuprocaine hydrochloride,OBPC-HCl）对体外培养人角膜内皮（HCE）细胞的影响作用,为眼科临床安全用药提供实验依据。方法：用不同浓度OBPC-HCl处理体外培养的HCE细胞,在倒置显微镜下观察细胞的生长和形态变化,用吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）荧光双染色法检测质膜的通透性,用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA的断片化,用透射电镜检测细胞的超微结构。结果：OBPC-HCl在62.5mg/L~4g/L的浓度范围内均能不同程度地引起HCE细胞出现细胞皱缩、胞内空泡化、质膜通透性增大、染色质凝缩、凋亡小体和DNA断片化等典型的细胞凋亡特征,并具有浓度和时间依赖性,临床使用浓度4g/L OBPC-HCl对HCE细胞的凋亡诱导作用最大,处理1h后HCE细胞的凋亡率已高达100%。结论：OBPC-HCl在62.5mg/L~4g/L的浓度范围内能显著诱导HCE细胞凋亡,在眼科临床应用中对HCE细胞的毒副作用极大。     

黄酮对体外培养人角膜内皮细胞的影响及其抗氧化作用

目的:确定黄酮对人角膜内皮细胞(human corneal endothelial cells,HCEC)的影响及其对因氧化损伤所致细胞凋亡的抗氧化保护作用。方法:利用体外培养的HCEC,通过添加不同浓度的黄酮继续培养,或经不同浓度黄酮预处理后再添加过氧化氢(H2O2)继续培养,采用光镜形态观察、吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)双染色和DNA琼脂糖凝胶电泳等技术手段,研究黄酮对HCEC的影响及其抗氧化作用。结果:黄酮浓度高于85μmol/L时可诱导HCEC发生细胞凋亡,而低于70μmol/L时对HCEC没有影响;55和70μmol/L黄酮预处理对600μmol/LH2O2所引起的HCEC细胞凋亡具有显著的抑制作用(60%→22%,8%;P<0.01),而85和100μmol/L黄酮预处理对H2O2所引起的HCEC细胞凋亡没有显著的抑制作用。结论:55~70μmol/L黄酮对HCEC具有显著的抗氧化保护作用,而浓度高于85μmol/L的黄酮反而能诱发HCEC发生细胞凋亡。     

人角膜内皮细胞体外氧化损伤及黄酮抗氧化保护作用的机制

目的:揭示黄酮对人角膜内皮细胞(human corneal endothe-lial cells,HCEC)的抗氧化保护作用及其机制。方法:利用HCEC的体外培养体系,采用形态观察,吖啶橙/溴化乙锭荧光双染色和DNA琼脂糖凝胶电泳等技术手段研究了黄酮和/或过氧化氢(H2O2)处理对HCEC细胞凋亡的影响,使用酶联免疫吸附试验分别对70μmol/L黄酮和/或600μmol/L H2O2处理不同时间后HCEC中凋亡诱导因子(AIF)与细胞色素c(CytC)的浓度变化进行了检测。结果:在600μmol/LH2O2处理8h,细胞凋亡率约为60%的HCEC氧化损伤模型中,70μmol/L黄酮预处理30min可使HCEC的细胞凋亡率降至约8%,而仅用黄酮处理组HCEC的细胞凋亡率约为1%。HCEC的总CytC浓度于H2O2处理3h后达到峰值(约为对照组的7.97倍),总AIF浓度于处理6h后达到峰值(约为对照组的1.28倍),而黄酮预处理组和仅用黄酮处理组HCEC的总CytC和AIF浓度与阴性对照组没有显著差异。结论:H2O2诱发HCEC凋亡是促使线粒体中CytC和AIF的外流引起的;70μmol/L黄酮对600μmol/L H2O2所致HCEC细胞凋亡具有很强的抗氧化保护作用。     

组织工程角膜内皮的体外构建及在猕猴角膜移植中的应用

目的体外构建出形态结构功能正常的组织工程人角膜内皮（TE-HCE）,并以猕猴动物模型验证其维持角膜透明的作用。方法实验研究。以非转染人角膜内皮单克隆细胞株细胞（mcHCE细胞）为种子细胞,以去上皮层修饰羊膜（mdAM）为载体支架体外构建出TE-HCE,对其透明度、形态、细胞密度、组织学结构、超微结构、功能蛋白的荧光表达进行检测;采用穿透性角膜移植手术（PKP）对猕猴右眼分别移植TE-HCE（3眼,TE-HCE组）和mdAM（3眼,mdAM组）,未移植的左眼作为正常对照眼（6眼,对照组）,利用裂隙灯显微镜、角膜内皮镜、角膜测厚仪和眼压计对术后动物的角膜透明度、角膜内皮细胞密度（ECD）、中央角膜厚度（CCT）和眼压（IOP）进行在体检测,并利用荧光显微镜检测移植眼角膜内皮细胞的CM-DiI标记。数据处理均采用单因素方差分析。结果体外构建的TE-HCE透明度高,具有与活体角膜内皮近似的形态结构,单层细胞密度高达（3 602±45）个/mm2,细胞连接蛋白和膜运输蛋白呈阳性表达;术后跟踪观测结果显示,TE-HCE移植眼的角膜没有出现明显的炎症和免疫排斥反应,角膜维持透明,虽然出现了轻度角膜水肿,但随着时间的推移CCT逐渐下降,术后181 d时单层细胞密度为（2 796±157）个/mm2;而mdAM移植眼的角膜则出现了明显的炎症反应,长入了新生血管,角膜持续混浊与水肿,厚度没有明显的下降趋势;各组间IOP的变化无明显差异。CM-DiI荧光检测结果显示TE-HCE移植眼的角膜内皮移植区的细胞均带有CM-DiI标记（来自于移植的TE-HCE）。结论体外构建的高密度TE-HCE具有正常的形态结构,且功能蛋白表达正常,移植后能使猕猴角膜逐渐恢复透明度和厚度,表明TE-HCE在体内可重建出功能正常的角膜内皮,有望用于角膜内皮异常疾病的临床治疗。