糖基化修饰促进内含肽剪接的凝血因子Ⅷ的分泌和活性

目的 观察糖基化修饰对内含肽剪接的B区缺失型凝血因子Ⅷ(BDD-FⅧ)分泌的影响.方法 将含有6个潜在的天冬酰胺糖基化位点(N6)的FⅧ的B区226个氨基酸引入BDD-FⅧ重链,用双载体转融合内含肽的此重链和轻链基因(N6HCIntN和IntCLC)至培养的293细胞,用酶联免疫吸附试验(ELISA)和Coatest发色法分别检测基因共转染细胞分泌至培养上清的剪接BDD-FⅧ蛋白量和凝血生物活性.结果 共转染N6HCIntN和IntCLC基因细胞上清中BDD-FⅧ蛋白浓度为(123±18)ng/ml,凝血活性为(0.94±0.11)U/ml,明显高于共转染内含肽融合的无糖基化修饰重链(HCIntN)和IntCLC基因细胞上清的BDD-FⅧ蛋白浓度[(86±12)ng/ml]和凝血活性[(0.65±0.07)U/ml,均P＜0.05].分别转染N6HCIntN和IntCLC基因细胞混合培养后的上清中亦检测到剪接的BDD-FⅧ蛋白和凝血活性[(18±6)ng/ml,(0.15±0.05)U/ml].结论 糖基化修饰可促进内含肽剪接的BDD-FⅧ的分泌并表现出不依赖细胞机制的蛋白质剪接功能.     

双载体断裂CFTR基因转移及翻译后的连接和功能

囊性纤维化跨膜电导调节体 (CFTR) 基因突变导致一种常染色体隐性遗传病囊性纤维化 (CF), 利用腺辅助病毒 (AAV) 载体转运CFTR基因的基因疗法受到AAV载体容量的限制。本文采用intein的蛋白质反式剪接技术, 以双载体转运CFTR基因, 研究了于其调节结构域 (R) 断裂成两部分的CFTR基因翻译后的连接及其产生的Cl⁻通道功能。将人CFTR cDNA于R结构域的Ser⁷¹²密码子前断裂, 构建一对融合Ssp DnaB intein编码序列的真核表达载体。将这对载体共转染培养的幼年仓鼠肾 (BHK) 细胞, 通过瞬时表达, 全细胞和单通道膜片钳记录Cl⁻电流, 并用Western blotting观察CFTR蛋白的剪接。结果表明, 共转染细胞显示较高的全细胞Cl⁻电流和单个Cl⁻通道开放活性, 说明CFTR的Cl⁻通道功能的恢复, 用CFTR特异性抗体进行的细胞总蛋白Western blotting显示有完整的CFTR蛋白条带形成, 表明intein可有效连接翻译后的两部分CFTR蛋白。结果提示, 蛋白质剪接技术可有效用于双载体系统转运CFTR基因, 为进一步应用双AAV载体转运CFTR基因的CF基因治疗研究提供了实验依据。     

AR-3可增强内含肽介导的全长凝血因子Ⅷ的基因表达

目的 观察具有促进凝血因子Ⅷ(fⅧ)重链分泌的酸性区3(AR-3)对蛋白质剪接作用连接的全长fⅧ分泌的影响.方法 以双载体转融合内含肽的全长fⅧ重链和轻链基因,并将AR-3融合于重链基因,瞬时共转培养的293细胞,用Western印迹观察转基因细胞内的蛋白质剪接;用酶联免疫吸附试验(ELISA)和Coatest法定量分析分泌至培养上清中的剪接的全长fⅧ蛋白和由其产生的生物活性.结果 共转基因细胞内可见明显的剪接fⅧ蛋白形成,培养上清中剪接的fⅧ蛋白量和活性分别为(1 12±18)ng/ml和(0.76±0.13)U/ml,明显高于共转未融合AR-3的重链与轻链基因细胞[(64±11)ng/ml和(0.37±0.05)U/ml],而且,混合培养的分别单独转AR-3融合重链和轻链基因细胞的上清中亦检测到剪接的fⅧ蛋白及活性[(27±7)ng/ml和(0.16±0.05)U/ml].结论 AR-3可通过改善内含肽剪接的全长fⅧ的分泌增强转fⅧ基因的效果.     

脱氧萎镰菌醇通过下调GRP78提高双链转FVⅢ基因细胞分泌重链和生物活性

双链转凝血VⅢ因子(FVⅢ)基因是克服AAV载体容量限制的有效方法,但重链分泌的低效性带来链不均衡性。本文旨在用脱氧萎镰菌醇(deoxynivalenol,DON)降解内质网分子伴侣蛋白GRP78,通过减少重链与GRP78的结合提高重链分泌,改善双链转FVⅢ基因的功效。用DON处理双链共转基因细胞,观察了双链转FVⅢ基因293细胞分泌的重链和FVⅢ活性。结果显示,用500 ng.mL-1 DON处理细胞3 h后,GRP78蛋白水平明显降低,细胞的生长不受明显影响;单独转FVIII重链基因的DON处理细胞分泌的重链量[(59±11)ng.mL-1]明显高于对照细胞[(15±4)ng.mL-1],双链共转基因时重链的分泌量进一步增加,为(146±34)ng.mL-1,活性达到(0.66±0.15)U.mL-1,明显高于双链转基因对照细胞[分别为(76±17)ng.mL-1和(0.35±0.09)U.mL-1]。结果表明,DON可通过下调GRP78改善重链的分泌性,提高双链转FVⅢ基因的功效,为进一步动物体内双AAV载体转FVⅢ基因提供了实验依据。     

vWF促进intein剪接的BDD-FVⅢ的分泌和活性

vWF是由巨核细胞和血管内皮细胞合成的糖蛋白,其主要功能之一为凝血VIII因子(FVIII)的载体,防止后者被血浆酶降解。作者最近的工作证明intein可应用于双载体转移B结构域缺失型FVIII(BDD-FVIII)基因,通过翻译后的蛋白质反式剪接形成完整的功能性BDD-FVIII蛋白。为了研究vWF对于intein连接的BDD-FVIII分泌和活性的影响,通过intein融合的BDD-FVIII重、轻链基因和vWF基因共转染培养的293细胞,采用ELISA观察了分泌至培养上清液中的由intein剪接的全长BDD-FVIII抗原量,并用Coatest检测了由其产生的活性。结果显示,vWF基因共转染细胞上清液中,全长BDD-FVIII抗原量为(235±21)ng·mL-1,活性为(1.98±0.2)u·mL-1,明显高于未转染vWF的细胞[(110±18)ng·mL-1和(1.10±0.15)u·mL-1],也明显高于单独转染BDD-FVIII基因的对照细胞[(131±25)ng·mL-1和(1.22±0.18)u·mL-1],表明vWF基因共转染可显著改善双载体转BDD-FVIII基因后intein剪接的BD...     

RNAi介导的Bip表达下调促进基于蛋白质剪接的双链共转基因细胞分泌FVIII凝血活性

目的 探讨用RNA干扰技术下调内质网蛋白伴侣免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的表达,对基于蛋白质剪接的双链共转凝血因子VIII (FⅧ)基因HEK293细胞分泌剪接FⅧ蛋白的量和活性的影响.方法 以培养的HEK293细胞,用含蛋白内含子的B区缺失型FⅧ( BDD-FⅧ)的重链和轻链基因表达载体共转染经Bip-siRNA处理的细胞,免疫印迹法检测Bip的表达,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞生长,用酶联免疫吸附( ELISA)和发色分析法分析转基因细胞分泌的剪接BDD-FⅧ蛋白量和活性.结果 RNA干扰下调Bip表达作用明显,细胞生长不受影响;Bip下调的共转基因细胞分泌的剪接BDD-FⅧ和重链量分别为(142±33) μg/L和(197±43) μg/L,明显高于对照细胞[分别为(89±23)μg/L和(120±27) μg/L];Bip下调的共转基因细胞分泌的FⅧ凝血活性为(1 050±160)IU/L,明显高于对照细胞[640±170(IU/L)].结论 Bip表达下调通过促进剪接BDD-FⅧ的分泌可有效提高基于蛋白质剪接的双载体转BDD-FⅧ基因功效,为进一步动物体内实验提供了依据.     

蜜环菌菌丝体液体培养条件的优化

目的:对蜜环菌的液体培养条件进行优化,确定蜜环菌菌丝体的适宜培养条件。方法:通过测定菌丝体生物量的方法,利用液体摇瓶培养方式,筛选适宜的碳源、氮源、无机盐和生长因子,用统计学方法确定液体发酵培养基中碳源、氮源、无机盐和生长因子的最适浓度,最终确定蜜环菌的液体培养基配方。结果:碳源的最适种类为糊精,氮源最适种类为豆饼粉提取液,玉米浆、硫胺素都有促生长作用,乙醇作为小分子碳源对蜜环菌菌体生长有显著促进作用,培养基中添加硫酸铵和硝酸钠对菌体生长有抑制作用,添加磷酸二氢钾促进菌体生长。结论:通过对液体发酵培养条件优化,蜜环菌液体培养的培养基配方如下:25%的豆饼粉提取液,2%的玉米浆,2.5%的糊精,0.06%的硫胺素,1.0%的乙醇,0.3%的磷酸二氢钾,pH值6.0。以此培养基培养蜜环菌,最终菌丝体收率可达到1.9 g/100m l。     

轻链二硫键缺失突变促进链间重组二硫键BDD-FVⅢ变构体分泌

凝血VⅢ因子(coagulation factor VⅢ, FVⅢ)分子内含有8对二硫键,参与维持其结构和功能,轻链A3结构域中Cys1899/Cys1903间的二硫键阻碍分泌,本室曾通过在FVⅢ重链和轻链间引入重组二硫键,证明其可促进消除B结构域的FVⅢ (B domain-deleted FVⅢ, BDD-FVⅢ)重、轻链异源二聚体的组装和分泌。本文在此基础上将BDD-FVⅢ的重链A2区Met662和轻链A3区Asp1828突变为Cys,从而构建可形成链间二硫键的变构体F8C。将F8C轻链A3区Cys1899和Cys1903突变为Gly,从而消除内源性二硫键,得到变构体F8CG,并探索这两种BDD-FVⅢ变构体的分泌促进作用。通过HEK293和COS-7细胞的基因瞬时转染实验,检测细胞表达变构体多肽的二硫键形成情况和培养上清中变构体多肽的分泌量和凝血活性,并检测变构体的血管性血友病因子(von Willebrand factor, vWF)结合力。结果显示,细胞转基因表达产物F8C和F8CG均以二硫键连接的异源二聚体多肽为主,而野生型BDD-FVⅢ以易于解离的异源二聚体多肽为主。F8C分泌量和活性明显高于野生型BDD-FVⅢ, F8CG的分泌量和活性相对于F8C得到进一步提高,显示轻链二硫键的破坏对分泌具有促进作用,而对vWF的结合力无显著性影响。本文为进一步的变构体体内转基因研究奠定了基础。