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目的 构建微小RNA 145(microRNA-145,miR-145)过表达及干扰腺病毒载体,并探究miR-145对内皮细胞增殖和血管新生的影响及机制.方法 利用T4连接酶分别将miR-145过表达和干扰目的序列插入到pHBAd-EF1-MCS-GFP和pHBAd-U6-CMV-GFP载体,构建出重组miR-145过表达和干扰腺病毒质粒.将重组miR-145过表达和干扰腺病毒质粒分别与骨架质粒pHBAd-BHG共转染人胚肾HEK293细胞进行重组腺病毒的包装与扩增,TCID50法检测病毒感染滴度.miRNA qRT-PCR检测感染腺病毒的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)中miR-145的表达水平,MTT及Western blot检测PCNA蛋白表达量以检测细胞增殖情况.小管形成实验检测血管生成能力的变化.采用miRanda、miRwalk等生物信息学方法预测miR-145的靶基因及与环磷腺苷反应元件结合蛋白(cAMP response element-binding protein,CREB) 3'UTR的结合位点.Western blot检测CREB及其调控的VEGF的表达情况,双荧光素酶实验验证miR-145与目的基因CREB 3'UTR相互作用.结果 基因测序提示miR-145过表达及干扰质粒序列与目标序列一致,qRT-PCR结果亦提示病毒构建成功.细胞增殖和小管形成实验结果显示,与转染空载体组相比,过表达miR-145使570 nm处光密度值明显降低(P＜0.05),亦显著抑制了HUVECs PCNA蛋白表达和小管样结构的形成(P＜0.01),而干扰miR-145表达则使光密度值增高(P＜0.01),亦促进HUVECs PCNA蛋白表达和小管样结构的形成(P＜0.05).同时,过表达miR-145可显著抑制CREB和VEGF蛋白表达(P＜0.05),而干扰miR-145表达则明显促进CREB和VEGF蛋白上调(P＜0.05).双荧光素酶实验亦证实了miR-145与CREB 3'UTR的直接结合作用.结论 miR-145调节内皮细胞增殖和血管新生,其机制与miR-145直接靶向抑制CREB/VEGF信号有关. 相似文献
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