人CaMKKβ蛋白的原核表达、纯化及活性测定

目的对原核体系表达的CaMKKβ蛋白体外活性进行探索,为针对CaMKKβ、AMPK药物研发提供科研基础。方法克隆人CaMKKβ基因,建立原核表达载体pET28a-CaMKKβ,将其转化入E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞内,在16℃、0.02 mmol/L IPTG条件下诱导重组表达CaMKKβ蛋白,Ni-NTA纯化6His-CaMKKβ蛋白,并利用Glo?Max Assay方法检测其活性。结果通过基因测序表明pET28a-CaMKKβ质粒构建成功;重组人CaMKKβ蛋白可溶性表达量较高,Ni-NTA纯化6His-CaMKKβ蛋白纯度可达80%以上,活性检测结果表明,大肠杆菌体系内表达的人CaMKKβ蛋白在CaM/Ca2+存在与否情况下,酶活基本一致。结论成功构建原核表达载体pET28a-CaMKKβ,实现重组人CaMKKβ在原核体系内可溶性表达,活性测定表明原核体系内表达的CaMKKβ自主酶活性较强,受CaM/Ca2+影响较小。     

甘露糖加重ApoE缺陷小鼠的脂蛋白代谢紊乱

目的：探讨甘露糖暴露对载脂蛋白E(ApoE)缺陷小鼠高脂血症的影响及其机制。方法：6周龄雄性ApoE基因敲除小鼠在西方饮食同时给与2%甘露糖饮水4周。酶法检测血浆总胆固醇及甘油三酯水平,利用快速蛋白液相色谱分离血浆脂蛋白,并检测分析载脂蛋白和胆固醇水平的变化。利用RT-PCR和Western蛋白印迹,分别检测分析肝脏和空肠组织中脂蛋白代谢相关基因的mRNA和蛋白表达水平。结果：甘露糖饮水可显著升高ApoE缺陷小鼠的血浆总胆固醇和甘油三酯水平,同时伴有极低密度脂蛋白(VLDL)中胆固醇含量和载脂蛋白B100(ApoB100)蛋白水平显著升高、高密度脂蛋白(HDL)中载脂蛋白A1(ApoA1)和载脂蛋白A4(ApoA4)水平降低。血中ApoA1和ApoA4水平下调的机制与肝脏和空肠组织中的蛋白表达水平降低有关。结论：甘露糖暴露可影响ApoE缺陷小鼠的脂蛋白代谢,加重高脂血症。