人FAT1基因启动子的克隆鉴定及其功能浅析

目的：克隆人脂肪非典型钙黏蛋白1（FAT atypical cadherin 1,FAT1）基因启动子,找到核心启动子区域并对其转录调控机制进行初步分析。方法：通过PCR方法获得人FAT1基因5′上游1 163 bp（-1 029~+134 bp）的片段,亚克隆至pGL3?basic载体;通过步移缺失构建不同缺失片段的重组质粒。双荧光素酶报告活性分析检测各重组质粒在A549细胞和HEK293T细胞中的活性,找到核心启动子区域。利用生物信息学方法预测核心区域的转录因子结合位点。结果：经测序、酶切鉴定,成功构建了人FAT1启动子荧光素酶活性报告基因重组质粒。与pGL3?basic质粒相比,人FAT1启动子重组质粒的相对荧光素酶活性增加（P < 0.05）。通过生物信息学软件预测人FAT1启动子区域（-233~-110 bp）可能含有TFAP2C、KLF5等转录因子结合位点。结论：成功构建人FAT1启动子不同缺失片段的荧光素酶报告基因重组质粒。通过荧光素酶活性比较,推测人FAT1的核心启动子区域位于-233~+134 bp区域,其中可能含有若干转录因子结合位点。     

重组法国梧桐花粉过敏原2( rPla a2) 对诱导型一氧化氮合酶( NOS2)基因启动子活性及基因表达的影响

目的:构建人诱导型一氧化氮合酶(NOS2)基因启动子区,对NOS2 启动子序列进行鉴定并分析其活性;探索重组法国梧桐花粉过敏原2(rPla a2)对人NOS2 基因启动子活性及基因表达的影响。方法:利用PCR 扩增、限制性内切酶双酶切、DNA 连接酶连接、大肠杆菌转化等方法将NOS2 基因启动子区克隆至pGL3-Basic 载体上,将所构建重组报告质粒转染至人胚肾(HEK293T)细胞中,利用双荧光素酶活性分析检测该重组报告质粒启动子活性及检测rPla a2 对人NOS2 基因启动子活性的影响;用实时荧光定量PCR 法检测rPla a2 对人NOS2 基因mRNA 水平的影响。结果:成功构建含有NOS2 启动子的重组报告质粒,与对照(pGL3-Basic) 组相比,含NOS2 启动子区的重组质粒转染组荧光素酶活性显著增高;与不加刺激(NOS2)组相比,加入rPla a2 刺激后含NOS2 启动子区的重组报告质粒转染组荧光素酶活性显著增高,加入rPla a2 刺激后NOS2 mRNA 相对表达水平显著增高。结论:rPla a2 可增强人NOS2 基因启动子活性,并增加其基因表达。