糖尿病的基因治疗技术:大鼠胰岛素原基因真核细胞表达质粒构建与鉴定

目的:构建大鼠胰岛素原基因的真核细胞表达质粒pCMV/proinsulin并进行序列测定。方法:实验选用雄性SD大鼠1只,从大鼠胰腺组织中提取总RNA,通过RT-PCR法获得胰岛素原基因cDNA全长序列,并采用现代分子生物学技术,借助真核细胞表达质粒pCMV-Scriptvector具有多克隆酶切位点的特点,选择适当的限制性酶切位点(EcoRⅠ和HindⅢ),并使大鼠胰岛素原基因cDNA两端带有相同的酶切位点,利用其黏性末端进行定向克隆,从而将大鼠胰岛素原基因准确地插入到表达质粒pCMV上。结果:经RT-PCR法扩增并通过DNA核酸序列测定获得大鼠胰岛素原基因。经PCR法及酶切法初步筛选阳性克隆重组子,并进一步进行DNA核酸序列测定(双脱氧末端终止法),确定其序列与目的基因序列完全一致。结论:成功构建重组质粒pCMV/proinsulin,为进一步进行胰岛素原基因转染糖尿病大鼠和非胰岛β细胞,使之产生胰岛素、建立类胰岛β细胞系的研究奠定了扎实的基础。     

日本血吸虫重组抗原基因的高效表达和特性鉴定

为了获得有效的保护性抗原分子，我们对已构建的日本血吸虫成虫ｃＤＮＡ库的免疫筛选中所获得的阳性克隆λＳｊ５１４的。ＤＮＡ插入片段进行ＰＣＲ扩增，扩增产物亚克隆入高表达载体ｐＧＥＸ－１λｔ，得到高效表达克隆ｐＧＳｊ２４。经诱导表达生产出约２０ｋＤａ的分离表达产物，该特异性蛋白可被日本血吸虫免疫血清、感染兔血清和病人血清特异地识别，而且具有较强的免疫原性，可刺激动物产生较强的抗体反应。     

安徽省疟疾流行区疟疾间接荧光抗体水平的检测

1983年11月初,在安徽省和县卓庙乡新景大队大包村,以体外培养的恶性疟原虫(Pf)和猴体内的食蟹猴疟原虫(Pc)为抗原,进行间接荧光抗体试验,检测人群疟疾抗体水平。同时用厚血膜法调查原虫率。当用P_f抗原时,抗体阳性率为67.0％,用P抗原为81.9％。0～15岁的低年龄组,前者为41 8％,后者为62.7％。16岁以上用P_f抗原时为82.6％,P_f为92.7％,两者的阳性率都高。该组人群原虫率高达23.0％,其中单纯感染恶性疟者为16.3％,间日疟为5.6％,两者混合感染者为1.1％。调查结果证实:当地近年发生了比较严重的疟疾流行。     

日本血吸虫特异性IgE抗体相关肽表位的筛选与免疫学鉴定

目的　从噬菌体表面显示肽库筛选并鉴定日本血吸虫特异性IgE抗体相关表位。 方法用ABC 酶联免疫吸附 (ELISA)法检测日本血吸虫病流行区居民血清 15 0份 ,选择其中 15份具高滴度血吸虫特异性IgE抗体的血清 ,混合后经蛋白G柱亲和层析祛除IgG抗体 ,用于对 12肽的噬菌体表面显示肽库进行 5轮免疫亲和淘筛。从所获噬菌体克隆中挑取 35个克隆 ,经DNA序列测定 ,对各独立肽表位进行免疫学鉴定。结果　经 5轮筛选 ,DNA序列测定显示共有 4个独立噬菌体克隆 ,其中 phage 3和 phage 6有较多重复克隆存在 ,为优势克隆 ;Westernblot分析显示 ,筛库血清中特异性IgE抗体能有效识别各噬菌体克隆。分别用各克隆噬菌体免疫小鼠 ,均能诱导特异性IgE抗体产生。结论　从 12肽噬菌体表面显示肽库中成功筛选到日本血吸虫特异性IgE抗体相关肽表位。     

日本血吸虫(中国大陆株)22.6kDa重组抗原对小鼠免疫保护性的初步研究

目的：为研究日本血吸虫（中国大陆株）22．6kDa抗原的免疫保护性。方法：将其编码cDNA经PCR扩增后亚克隆入载体质粒PGEX—1λt进行表达，并用重组抗原免疫了一批昆明鼠。结果：与对照组相比，重组抗原免疫小鼠获得了38．93％的减虫率。结论：证明重组的日本血吸虫22．6kDa抗原可诱导宿主抗血吸虫感染的部分保护力。     

日本血吸虫重组线粒体相关蛋白免疫学活性鉴定

分子筛进一步纯化并复性的融合蛋白均能刺激家兔产生特异性抗体 ,粗提包涵体蛋白免疫家兔 ,血清抗体滴度为 1∶2 5 6 0 0 ,复性蛋白及经分子筛纯化的蛋白免疫的家兔血清抗体滴度均为 1∶5 12 0 0 ,Westernblot结果显示 ,粗提包涵体蛋白、复性蛋白及经过分子筛进一步纯化并复性的蛋白均能被重感染兔血清和rSj338/2 6GST特异性免疫兔血清所识别。攻击实验中 ,粗提包涵体蛋白和经分子筛纯化的蛋白分别可诱导小鼠产生 2 7.8% (P <0 .0 1)和 30 .4 % (P <0 .0 1)的减虫率 ,4 0 .4 % (P <0 .0 1)和 4 3.5 % (P <0 .0 1)肝总减卵率。粗提包涵体蛋白中rSj338和经分子筛纯化的蛋白中rSj338分别可诱导小鼠产生 13.9% (P <0 .0 5 )和 2 0 .0 % (P <0 .0 5 )的减虫率 ,30 .0 % (P <0 .0 1)和 4 1.7% (P <0 .0 1)肝总减卵率。结论　获得的日本血吸虫线粒体相关的重组融合蛋白(rSj338/2 6GST)具有良好的免疫学活性 ,重组融合蛋白 (rSj338/2 6GST)及rSj338均可诱导宿主抗血吸虫感染的部分保护力。     

日本血吸虫疫苗候选分子的基因克隆,表达及特性鉴定

本研究用日本血吸虫（Ｓｊ）成虫原抗原免疫的兔血清从日本血清吸虫中国大陆株成虫ｃＤＮＡ库筛选出Ｓｊ２２．６基因克隆；用根据曼氏血吸虫２３ｋＤａ膜抗原（Ｓｍ２３（的编码基因设计的引物，以ＰＣＲ法从日本血吸虫成虫ｃＤＮＡ库扩增出Ｓｊ２３基因；用根据日本血吸虫菲律宾株的磷酸丙糖异构酶（ＳｊＴＰＩ）基因设计的引物，以ＲＴ－ＰＣＲ从日本血吸虫中国大陆株成虫ｍＲＮＡ扩增出ＳｊＴＰＩ基因；并测得了上述３个基因的核     

使用微量乳胶凝集法诊断人体弓浆虫病

弓浆虫病的血清学诊断方法中最可靠的是颜料试验,但必须要活的弓浆虫和一些辅助条件,而且要求技术相当熟练,因而不适宜于检查大量标本。代替本法的多用血球凝集试验,但受试血清需先行灭活和吸收,为其缺点。以往采用的乳胶凝集反应方法虽简单,但其敏感性和特异性均不如其它方法。本研究的目的在于探讨采用微量试剂法的乳胶凝集反应能否用于人体弓浆虫病的诊断。     

表位疫苗:疫苗研制新策略

人类通过接种疫苗已控制了许多重大感染性疾病并且消灭了天花 ,这是有史以来 ,人类征服疾病最为辉煌的成绩。传统疫苗是将病原体灭活或减毒而制成的 ,但存在生物危害性和遗传变异致使原疫苗效力丧失等问题。表位疫苗 (epitopevaccine)是用抗原表位制备的疫苗 ,包括合成肽疫苗 (syntheticpeptidevaccine)、重组表位疫苗 (recombinantepitope basedvaccine)及表位核酸疫苗 (epitopeDNAvaccine ,minigenes/epigenes) ,是目前研制感染性疾病和恶性肿瘤疫苗的方向。1　表位疫苗研制的理论基础表位 (epitope)是抗原分子中决定抗原特异性的特殊化…     

光生物素化重组DNA探针对恶性疟病人的检测研究

本研究采用光生物素(PHOTOPROBE~(TM)BIOTIN)标记重组质粒pPF14作为探针,以斑点杂文试验检测恶性疟病人血样。共检测恶性疟病人35例,阳性29例;恶性疟原虫和间日疟原虫混合感染者1例为阳性。总计检测36例,阳性30例,阳性符合率为83.3％;正常人血样33例,阴性30例,阴性符合率为91％。此外,阳性检出率与原虫密度之间基本呈正相关,检出最低的虫血症水平为0.005％。