应用RNA干扰下调多药耐药蛋白4表达对结直肠癌细胞照射敏感性的影响

目的探讨多药耐药蛋白4（MRP4）表达对结直肠癌细胞照射敏感性的影响。方法应用慢病毒感染RNA干扰技术（RNAi）稳定下调人结直肠癌细胞株HCT116中MRP4的表达。将HCT116细胞分为未感染任何病毒的细胞株（CON）、加阴性对照病毒感染的细胞株（NC）和加RNAi靶点病毒感染的细胞株（KD）3组,应用实时定量RT-PCR和Western blot分别从RNA和蛋白水平检测MRP4表达变化,以验证RNAi的有效性。4Gy剂量照射后24h,流式细胞术检测细胞凋亡,MTT检测细胞增殖,比较RNAi后HCT116细胞株照射敏感性的差异。结果成功构建并转染慢病毒质粒,获得稳定沉默MRP4表达的HCT116-KD细胞株,HCT116-KD细胞株MRP4mRNA和蛋白表达水平较对照均明显下调（P〈0．05）。照射后24h,KD细胞株凋亡率为（71．7±0．8）％,明显高于CON组[（56．1±0．9）％]和NC组[（59．8±0．8）％]（P〈0．05）。照射后48h和72h,KD细胞增殖能力较对照组明显下降（火0．05）。结论MRP4在结直肠癌细胞中的表达水平与照射耐受显著相关,应用慢病毒感染RNA干扰下调MRP4表达可以增强结直肠癌细胞照射敏感性。MRP4有可能成为预测放疗敏感性的分子标志物。     

长链非编码RNA调节细胞周期素D1表达对结直肠癌细胞辐射敏感性的影响

目的筛选影响结直肠癌细胞辐射敏感性的长链非编码RNA（1ncRNA）并探讨其作用机制。方法选取RKO和Lovo结直肠癌细胞株梯度照光后行克隆形成实验。应用单击多靶数学模型计算存活分数SF2值并绘制剂量存活曲线：高通量IncRNA／mRNA芯片筛选在RKO与Lovo、以及2Gv照光前后RKO细胞中表达差异2倍以上的lncRNA基因和蛋白编码基因：采用GeneOntology联合Pathway综合分析阳性表达基因主要作用通路：实时PCR进一步检测验证RKO细胞株照光前后P53、P21、细胞周期素（cyclin）D1表达变化。结果克隆形成实验显示,Lovo细胞株SF2=0．47．RKO细胞株SF2=0．53,Lovo辐射敏感性显著高于RKO（P〈O．05）。高通量lncRNA／mRNA芯片筛选得到阳性表达长链非编码RNA基因268条,蛋白编码基因270条;GeneOntologv联合Pathway综合分析显示：细胞周期相关基因所占比重最大（38．6％）,并有多条lncRNA表达水平与cvclinD1编码基因CCNDl组间表达差异显著相关。RKO与Lovo两株细胞P53和P21相对表达量的差异均无统计学意义（P〉0．05）,RKO细胞cyclinD1相对表达量明显高于Lovo细胞（P〈0．05）;RKO细胞株经2Gy剂量照射前后,P53和P21相对表达量的差异无统计学意义（P〉0．05）,而cvclinD1表达明显下调（P〈0．05）。结论incRNA可能通过形成转录复合物与CCNDl基因结合,调节cvclinD1蛋白表达进而影响结直肠癌细胞辐射敏感性：且lncRNA对cvclinD1表达的调节不依赖于P53-P21-cyclinD1通路。     

Nemo样激酶在结直肠癌组织中的表达及其临床意义

目的研究Nemo样激酶（NLK）基因在结直肠癌组织中的表达情况及其临床意义。方法选取2001年1月至2009年12月间在上海第二军医大学附属长海医院肛肠外科行手术治疗患者的肠黏膜组织,其中正常黏膜组56例（行吻合器痔上黏膜环切钉合术的混合痔患者）;结直肠腺瘤组51例：结直肠癌组712例;转移性结直肠癌组21例。将选取的肠黏膜组织标本制作成组织芯片,采用Envision免疫组织化学法检测NLK的表达情况,并分析NLK的表达水平与临床病理因素的关系。结果NLK的表达阳性率从正常黏膜（75．0％,42／56）、结直肠腺瘤（86．3％,44／51）到结直肠癌[Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分别为92．5％（49／53）、90．1％（281／312）、91．9％（274／298）和98．0％（48／49）1依次升高。NLK的表达水平与结直肠癌淋巴结转移（P=0．027）、肿瘤远处转移（P=0．000）、肿瘤TNM分期（P=0．000）和复发率（P〈0．01）呈正相关。NLK在低分化和黏液腺癌结直肠癌中的表达（77．5％,62／80）低于高一中分化（93．4％,590／632;P=0．019）;在直肠癌中的表达水平（96．8％,361／373）明显高于结肠癌（85．8％,291／339;P〈0．01）。单因素和多因素分析显示,NLK的表达与结直肠癌患者总体生存率和无瘤生存率呈负相关（P〈0．01）,是结直肠癌患者的独立预测因素。NLK阳性表达率在21例转移性结直肠癌的正常黏膜、转移癌组织和原发癌组织中的表达率分别为57．1％（12／21）、76．2％（16／21）和81．0％（17／21）,后两者比较,差异无统计学意义（P=0．851）;而前者与原发癌比较,差异有统计学意义（P=0．010）。结论NLK在结直肠癌中可能发挥促癌作用,且具有预后判断的价值。