掺锶聚磷酸钙骨组织工程支架材料与成骨细胞及内皮细胞的相容性研究

目的:观察掺锶聚磷酸钙材料与成骨细胞及内皮细胞相容性,为该材料作为骨组织工程支架材料最终应用于临床提供实验依据。方法:实验于2006-01/07在四川大学组织工程研究室完成。在聚磷酸钙制备过程中掺入亲骨元素锶,制备新型的不同掺锶量(0.5%,1%,5%,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%)的骨组织工程支架材料掺锶聚磷酸钙。以聚磷酸钙、羟基磷灰石及磷酸三钙为对照,通过MTT法及扫描电镜观察掺锶聚磷酸钙的成骨细胞及血管内皮细胞的相容性。结果:无论是对成骨细胞还是内皮细胞,1%掺锶聚磷酸钙材料均显示出更好的相容性:MTT法表明,与对照组及其他掺锶量的掺锶聚磷酸钙比较,1%掺锶聚磷酸钙材料拥有更高的成骨细胞增殖度;与聚磷酸钙比较,1%掺锶聚磷酸钙材料拥有更高的内皮细胞增殖度;扫描电镜表明在1%掺锶聚磷酸钙材料表面生长的成骨细胞或内皮细胞具有更好的生长状态和生物活性。结论:掺锶聚磷酸钙是一个很有前途的骨组织工程支架材料,它不仅与成骨细胞具有很好的相容性,而且能促进内皮细胞的增殖及诱导新生血管的形成,有望解决植入材料血管化的难题。     

D,L-聚乳酸降解产物对内皮细胞生长影响的体外实验

目的:观察D,L-聚乳酸体外降解规律和降解产物对内皮细胞生长的影响。方法:实验于2006-06/12在四川大学细胞相容性研究室完成。将D,L-聚乳酸膜在生理盐水中体外无菌降解120d。①计算失质量率:失质量率(%)(降解前本体的质量-降解后本体的质量)/降解前本体的质量×100%。②测定黏均相对分子质量:用乌=氏黏度计外推法测降解后本体的特性黏度,特性黏度与黏均相对分子质量关系式为:η=2.21×104M0.77。③测定降解液的pH值。④乳酸标准曲线的制备:将乳酸稀释为0.16,0.08,0.048,0.032,0.016,0.008g/mL,于262nm的波长处测定吸光度值,对乳酸质量浓度做标准曲线。⑤将不同降解时间的降解液与内皮细胞共培养,分为3组,实验组分别加入不同降解时间的未经稀释的降解液100μL和新鲜培养基100μL,阴性对照组加入生理盐水100μL和培养基100μL,空白对照组加入培养基100μL,各组分别培养1,2,3,4,5,6d。采用MTT法测定内皮细胞的生长。结果:①失质量率:在最初2周内,失质量率增大较快。在20～70d失质量率变化不大。在80～120d失质量率快速增加。②黏均相对分子质量:从开始降解到70d,黏均相对分子质量呈直线下降趋势,之后随时间延长而趋于平缓,且相对分子质量很小。③pH值:前30dpH值下降很快,从6.32降到4.56;在30～70dpH值反而有所上升,上升到5.39;之后急剧下降,在120d时达到2.29。④乳酸的质量浓度:随降解时间延长而增大,前20d达到5.8g/L,70d为16.7g/L,120d时达到24.4g/L。⑤不同降解时间的降解液作用下内皮细胞的生长情况:前70d的降解液对内皮细胞生长有促进作用,70d后的降解液明显抑制内皮细胞生长,到120d时降解液使内皮细胞表现显著的细胞毒性,细胞出现凋亡。结论:D,L-聚乳酸膜降解后,70d前降解液促进内皮细胞生长,70d后至120d降解液对内皮细胞生长的影响从抑制作用到细胞毒性逐渐增强。本实验表明D,L-聚乳酸的降解产物在局部积累达一定浓度后对内皮细胞生长的微生态环境有极大的改变,将导致细胞毒性增强,甚至细胞凋亡。     

SCPP降解产物对血管内皮细胞迁移、增殖和F-肌动蛋白重组的影响

目的 研究骨组织工程支架材料掺锶聚磷酸钙(strontium-doped calcium polyphosphate, SCPP)的降解产物(degradation products, DPs)对血管形成密切相关的内皮细胞迁移、增殖和肌动蛋白微丝(F-actin)重组的影响,探索其对骨组织工程血管化的作用.方法 在聚磷酸钙(calcium polyphosphate, CPP)制备过程中掺锶制备SCPP多孔支架材料.生理盐水为降解介质,等离子体发射光谱检测降解液中DPs及浓度.用降解液处理脐静脉内皮细胞株ECV-304,噻唑蓝法和Millicell小室法分别检测细胞增殖和迁移.标记F-actin,荧光显微镜下观察.结果 与CPP和生理盐水组比较.结果 掺锶前后,孔隙率分别为(65±5)%和(64±5)%.SCPP各天降解液中Sr浓度为1.222～1.808 mg/L,约为CPP组的20～40倍,但Ca和P较低.SCPP组细胞增殖和迁移数显著高于CPP组和生理盐水,细胞中F-actin重组形成应力纤维数量明显增多.结论 SCPP的降解液能明显促进ECV-304的增殖.Sr是影响增殖的关键因素,SCPP降解液还能促进ECV-304的迁移,引起F-actin重组,形成与细胞迁移密切相关的应力纤维可能是促进迁移的原因之一.SCPP用作骨组织工程支架可能促进血管形成.     

骨修复材料聚磷酸钙聚合度对其显微结构及体外降解性能的影响

目的:观察骨修复材料聚磷酸钙聚合度对其显微结构及体外降解性能的影响。方法:实验于2006-02/05在四川大学组织工程支架材料研究室完成。通过控制煅烧时间制备得到具有不同聚合度的聚磷酸钙材料。使用液相31P核磁共振法对聚磷酸钙聚合度进行测定。同时,采用X射线衍射仪及扫描电镜对试样进行表征。以生理盐水为递质,进行32d的体外降解实验,在不同时间使用钼蓝光度法对降解液中磷的质量浓度进行测定,降解过程中计算失重率:失重率(%)=[(W0-Wt)/W0]×100%。结果:①聚磷酸钙聚合度随着煅烧时间(3,5,7,10h)的延长而增加,分别为9,13,17,19。②X射线衍射结果表明,聚合度对聚磷酸钙晶型无影响。③扫描电镜图片显示当聚合度大于9时,晶粒清晰可见。同时,晶界变薄,即非晶区变少。④32d体外降解实验结果表明,聚合度为13的聚磷酸钙材料的降解速率最快,失重率约是聚合度为9,19的3倍。结论:不同聚合度的聚磷酸钙的显微结构不同并对其降解性能有一定影响,通过改变聚磷酸钙的聚合度从而调节其降解速率,配合其他影响因素对降解速率的调控可以达到满足临床骨修复要求。     

壳聚糖体外降解及降解产物对内皮细胞增殖的影响

目的 研究壳聚糖体外降解的规律及不同降解时间其产物对血管形成密切相关的内皮细胞增殖的影响,为壳聚糖在组织工程血管化方面的应用提供参考.方法 以生理盐水为降解介质对壳聚糖膜进行体外降解,用失重率、黏均分子量变化和FTIR表征降解本体的变化规律,用降解液pH值和降解产物中氨基葡萄糖浓度变化表征降解产物的变化规律;将降解液与内皮细胞共培养,用MTT法检测内皮细胞增殖情况,并与氨基葡萄糖单体培养后内皮细胞增殖结果进行比较.结果 壳聚糖膜在生理盐水中的降解是壳聚糖分子链中β-(1,4)糖苷键断裂引起的,降解缓慢,120 d失重率为19.48%,降解过程中黏均分子量减小,最终产物为氨基葡萄糖,其浓度不断增大,降解产物的累积使pH值升高.不同时间降解产物中氨基葡萄糖浓度都在氨基葡萄糖单体促进内皮细胞增殖的范围内,前期和后期的降解产物促进内皮细胞增殖,但降解中期21～90 d的降解产物对内皮细胞的增殖有抑制作用,表明氨基葡萄糖单体并非影响内皮细胞增殖的主要因素.结论 壳聚糖体外降解缓慢,降解最终产物为氨基葡萄糖,其降解产物对内皮细胞增殖在降解中期抑制,前期和后期促进,其主要影响因素不是氨基葡萄糖单体.本研究可为壳聚糖在组织工程血管化方面的应用提供参考.     

影响掺锶聚磷酸钙降解速率的工艺条件

目的:观察不同工艺条件下对掺锶聚磷酸钙降解速率的影响。方法:实验于2006-02/05在四川大学组织工程支架材料研究室完成。通过分别控制保温时间(3,5,7h)制备3种不同聚合度的掺锶聚磷酸钙烧料,将烧料分别在700,800,900℃下煅烧得到不同工艺条件的掺锶聚磷酸钙材料样品,并在三羟甲基氨基甲烷-氯化氢溶液中进行45d的降解实验。用31P核磁共振波谱仪检测其聚合度,扫描电镜观察其表面形貌变化,钼蓝比色法检测PO43-的质量浓度以表征其降解速率。结果:①31P核磁共振波谱表明,随着保温时间的延长,掺锶聚磷酸钙的聚合度逐渐增大,3种掺锶聚磷酸钙烧料的聚合度分别为9,13,19。②掺锶聚磷酸钙降解速率并不随聚合度增长而呈一单调变化的趋势。在相同的煅烧温度下,掺锶聚磷酸钙的降解速率由高到低分别为聚合度为13,9,19的掺锶聚磷酸钙。聚合度为13的掺锶聚磷酸钙降解液中PO43-的质量浓度达到0.44g/L;相同保温时间下,掺锶聚磷酸钙的降解速率随煅烧温度的升高而增大。③扫描电镜显示,降解速率快的掺锶聚磷酸钙表面有CaP沉积物。结论:不同工艺条件下掺锶聚磷酸钙的降解速率不同,通过调节保温时间和煅烧温度可以在一定程度上调控掺锶聚磷酸钙的降解速率。     

壳聚糖/海藻酸钠自组装微球的制备及释药性能

目的利用壳聚糖(CS)聚阳离子及海藻酸钠(ALG)聚阴离子电解质的性质,在药物微球表面自组装形成多层包覆结构的壳聚糖载药微球,并研究组装层数、温度及盐离子浓度对自组装微球释药性能的影响。方法采用乳化交联法制备CS载四环素(TC)的药物微球,并在其表面交替自组装ALG及CS。利用IR测试技术及电极电位法进行表征。结果CS交联微球未破坏CS及TC的结构,CS与ALG以静电作用相结合。CS交联微球的载药量为40.2%,自组装六层的微球载药量为32%。组装后,药物释放时间延长,初期暴释现象得到极大改善,释药速率随组装层数的增加而下降,温度较高时组装完整,盐离子浓度存在较佳点。结论温度为60℃、盐离子浓度为0.5 mol.L-1、组装层数为四层的微球释药性能较佳。