脑胶质瘤组织中R132H突变型hIDH1基因双顺反子真核表达载体的构建及鉴定

目的以pcDNA3.1(+)为骨架,构建并鉴定人脑胶质瘤组织中含R132H突变的人源异柠檬酸脱氢酶1基因(hIDH1R132H)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)序列的双顺反子真核表达载体。方法以内部核糖体进入位点(IRES)/EGFP片段为模板,扩增出IRES/EGFP片段,并在5’末端引入3×Flag标签;通过PCR介导的定点突变法,以pCMV-sports6-hIDH1为模板,扩增hIDH1R132H基因片段,并在3’末端引入3×Flag标签;通过PCR连接两种产物后经双酶切定向克隆入pcDNA3.1(+)骨架;转化大肠杆菌后挑取阳性克隆,提取质粒进行PCR检测及基因序列测定。结果 PCR检测7个菌落中有6个阳性克隆,DNA测序发现引入了hIDH1基因。结论成功构建了双顺反子真核表达载体pcDNA3.1(+)-hIDH1R132H/3×Flag/IRES/EGFP,为研究人胶质瘤组织中R132H突变的作用机制奠定了基础。     

脊髓背角小胶质细胞组织蛋白酶S在大鼠骨癌痛维持中的作用

目的 探讨脊髓背角小胶质细胞组织蛋白酶S(CatS)在大鼠骨癌痛维持中的作用.方法 雌性未交配SD大鼠50只,4～6周龄,体重150～ 180 g,采用随机数字表法,将其分为5组(n=10):假手术组(S组)、骨癌痛组(BCP组)、假手术+CatS抑制剂吗啉亮氨酸高苯丙氨酸乙烯基苯基砜(LHVS)组(S+L组)、骨癌痛+二甲基亚砜组(BCP+D组)和骨癌痛+LHVS组(BCP+L组).左侧胫骨骨髓腔内接种浓度为2×107/ml Walker256细胞5μl制备大鼠骨癌痛模型.分别于造模后10、11、12d时S+L组和BCP+L组鞘内注射LHVS 50 nmol/10l,1次/d,BCP+D组给予等容量二甲基亚砜.分别于造模前1d(基础状态)及造模后3、6、9、10、11、12 d(T0-6)测定机械缩爪反应阈(MWT),分别于鞘内给药前、鞘内给药后0.5、1.0、3.0、6.0、9.0、12.0、24.0 h时测定(MWT).处死大鼠,取L4-6脊髓组织,采用免疫组化法测定OX-42表达.结果 与S组比较,BCP组、BCP+D组和BCP+L组T2-6时MWT降低,脊髓背角OX-42表达上调(P＜0.01),S+L组MWT和脊髓背角OX-42表达差异无统计学意义(P＞0.05);与BCP组比较,BCP+L组T4-6时MWT升高,脊髓背角OX-42表达下调(P＜0.01),BCP+D组MWT和脊髓背角0X-42表达差异无统计学意义(P＞0.05).S+L组和BCP+D组鞘内给药后3.0、6.0、9.0h时MWT低于BCP+D组(P＜0.01).结论 脊髓背角小胶质细胞CatS激活参与了大鼠骨癌痛的维持.     

在荷瘤裸小鼠体内研究抗癌药物筛选流程

为了寻找抗癌新药,全世界已筛选了约60万种有关物质,被推荐到临床使用的亦有数百种之多,但对人体癌瘤治疗确实有效的尚不足50种。筛选成功率小于万分之一,说明筛选工作有“大海捞针”之难度,故要求我们从速改进现有的筛选体系与方法。     

人源Dickkopf-1真核表达质粒的构建

目的构建人源Dickkopf-1（DKK-1）基因的真核表达质粒,为进一步探讨DKK-1的生物学功能奠定基础。方法Trizol法从人新鲜胎盘组织中抽提总RNA,RT-PCR法反转录为cDNA,以cDNA为模板扩增人源DKK-1的基因序列,将真核表达载体pcDNA3.1和DKK-1的PCR产物分别在双酶切后用T4连接酶连接,构建重组质粒pcDNA3.1-DKK-l,转化至大肠杆菌后经菌落PCR、NHeⅠ和EcoRⅠ双酶切及测序鉴定。结果RT-PCR法从人胎盘中扩增出816bp大小的目的片段,重组质粒转化至大肠杆菌后菌落PCR同样扩增出816bp大小的目的片段,NHeⅠ和EcoRⅠ双酶切重组质粒能切出两条目的条带,测序后与Genbank中DKK-1的cDNA对比,证明DKK-1的基因序列完全正确。结论成功构建了pcDNA3.1-DKK-1重组质粒,为研究人源DKK-1的功能及其在细胞系中的作用奠定了基础。     

RNA干扰抑制c-myc基因表达对D341细胞增殖的影响

目的探讨应用小干扰RNA（siRNA）技术抑制髓母细胞瘤D341细胞株的c-myc基因对D341细胞的生长、细胞周期及凋亡的变化。方法制备特异性针对c-myc基因的siRNA,转染D341细胞,实时定量RT-PCR、Western blot检测c-myc基因表达情况,流式细胞仪进行细胞周期及凋亡检测。结果siRNA转染D341细胞后,c-myc基因表达在转染后24h抑制效率最高,c-myc蛋白在48h抑制效率最高,并随siRNA浓度的增大,沉默c-myc基因效率增高。RNA干扰抑制D341细胞c-myc基因后,细胞生长停滞于G1期。结论针对c-myc基因的siRNA对D341细胞c-mycmRNA及蛋白有明显抑制作用,细胞生长受到抑制,有望成为髓母细胞瘤的新的治疗途径。     

~3H-TdR掺入法测定NHG-1脾淋巴细胞转化功能

本文报告用~3H-TdR掺入法测定本室的NC系正常裸小鼠和荷人脑胶质瘤裸小鼠(NHG-1)的脾淋巴细胞转化功能。结果提示:正常的纯合子(nu/nu)T细胞缺乏,B细胞功能均正常;杂合子(nu/ )的T和B细胞功能均正常;荷瘤鼠(NHG-1,30代)除了T细胞缺乏,B细胞功能亦受到抑制。     

重症胸部创伤大鼠Th1／Th2平衡变化的实验研究

目的检测重症胸部创伤大鼠受伤后7d外周血单个核细胞（PBMC）培养上清液γ-干扰素（IFN-γ）、白细胞介素4（IL-4）水平,研究其Th1、Th2细胞功能的动态变化。方法雄性SD大鼠20只随机分为对照组与创伤组,创伤组大鼠进行胸部撞击建立重症胸部创伤模型,对照组进行假撞击。分别于受伤前及受伤后第1、3、5、7天取全血各1．0ml,分离PBMC体外培养72h,收集上清液冻存,ELISA法集中检测IFN-γ、IL-4浓度。结果两组大鼠伤后IFN-γ、IL-4水平均迅速升高,但创伤组IFN-γ水平低于对照组,而IL-4水平高于对照组。两组大鼠IFN-γ上升倍数／IL-4上升倍数（△IFN-γ/△IL-4）比值伤后均升高,创伤组在伤后第3天恢复1．0左右、并继续降低至0．34,对照组伤后7d内始终高于1．0。结论轻度创伤可以诱导大鼠Th1细胞功能加强;重症创伤大鼠在伤后早期以Th1细胞功能增强为主,创伤急性期后随着Th2细胞功能持续增强、Th1细胞功能受到抑制,发生Th1细胞向Th2细胞的漂移。     

Dickkopf1在两株人脑胶质瘤细胞株中的表达分析

目的检测Dickkopf1（DKK1）在人胶质瘤细胞株MGR3和UWR7中的表达情况。方法采用酶联免疫吸附实验,逆转录多聚酶链反应等方法对DKK1在人胶质瘤细胞株MGR3和UWR7中表达水平进行检测。结果酶联免疫吸附实验提示DKK1在MGR3和UWR7中均呈高浓度;逆转录多聚酶链反应提示DKK1基因在胶质瘤细胞株MGR3和UWR7中高表达,但在正常脑组织中表达不明显。结论DKK1在人胶质瘤细胞株MGR3和UWR7中高表达,提示DKK1可能在胶质瘤中的发生发展中起重要作用。     

DKK1在胶质瘤中的表达分析及其与肿瘤恶性程度的相关性

背景与目的：DKK基因在胶质瘤中的表达及意义尚不清楚,本研究检测分析胶质瘤中DKK1的表达情况及探讨与胶质瘤级别之间的关系。方法：ELISA、免疫组织化学检测培养细胞株/系、脑脊液、血清和胶质瘤组织标本中的蛋白表达,半定量RT-PCR检测DKK1胶质瘤培养细胞中培养细胞株/系、胶质瘤组织标本基因表达,统计不同级别胶质瘤间DKK1表达的差异。结果：ELISA检测结果示高级别胶质瘤细胞组中DKK1蛋白量显著高于低级别胶质瘤细胞及正常对照组（P〈0.05）。脑脊液中胶质瘤组DKK1含量显著高于神经系统良性肿瘤组及正常对照组;血清中胶质瘤组、神经系统良性肿瘤组及正常对照组之间DKK1含量差异均未见统计学意义。免疫组织化学结果显示胶质瘤组织中DKK1阳性率（91.5%,43/47）高于正常脑组织中阳性率（18.1%,2/11）,且DKK1在胶质瘤组织中的表达与肿瘤病理分级呈正相关。半定量RT-PCR结果显示胶质母细胞瘤细胞株/系的DKK1基因扩增产物均有特异性条带,SHG44、D341和正常对照组人脑星形胶质细胞则无;胶质瘤组织中灰度值高于正常组织,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：DKK1在胶质瘤中高表达,且随着肿瘤级别的增高而增高;胶质瘤脑脊液中DKK1含量显著高于神经系统良性肿瘤组及正常对照组,可作为胶质瘤鉴别诊断指标。