艾滋病痴呆综合征患者HIV-1B gp120基因的克隆及真核表达

目的 克隆艾滋病痴呆综合征(ADC)患者体内不同部位的HIV-1B gp120基因,并在人神经胶质瘤细胞U87中表达.方法 分别以一例ADC患者尸检标本的外周(淋巴结)和中枢(脉络丛、大脑枕叶白质)来源的基因组DNA为模板,PCR扩增HIV-1 gp120基因,序列测定后,将目的基因插入表达载体pcDNA3.1(+),构建重组表达载体gp120/pcDNA3.1(+),将所构建的重组表达载体用脂质体法转染人神经胶质瘤U87细胞,间接免疫荧光法测定HIV-IB gp120的表达情况.结果 克隆了ADC患者体内外周淋巴结、脉络丛、大脑枕叶白质3个部位的HIV-1B gp120基因,所构建的表达质粒gp120/pcDNA3.1(+)转染U87细胞后可表达目的蛋白.结论 ADC患者不同部位来源的HIV-1B gp120基因均可在U87细胞中表达,为进一步研究HIV-1B gp120包膜蛋白的神经毒性及其作用机制提供条件.     

艾滋病痴呆综合症患者体内HIV-1 tat基因的克隆及原核表达

目的     探讨艾滋病痴呆综合症（AIDS dementia complex,ADC）患者体内外周和中枢不同组织部位的人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）反式激活因子（tat）第一外显子基因序列的变异并对其进行表达,用于研究HIV-1 Tat变异对其神经毒性的影响。方法     从ADC病例尸检标本的脾脏（spleen,SPL）、脑膜（meninges, MG）和基底核（basal ganglia,BG）3个部位的组织中提取基因组DNA,用PCR方法扩增出tat第一外显子基因,并将其插入到pGEM-T克隆载体中,测序证实为HIV-1 tat基因,BioEdit软件对测序结果进行比对。将克隆载体双酶切,回收目的基因,并将其连接到pGEX-KG表达载体中,将重组表达质粒pGEX-KG-tat转化BL21大肠杆菌,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达,表达产物用SDS PAGE和Western blot进行检验和鉴定。结果    成功克隆了HIV-1 tat第一外显子基因,序列比对发现外周和中枢部位的Tat氨基酸序列不同;构建了pGEX KG-tat重组表达载体,并在原核细胞中高效表达了谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合Tat蛋白,SDS PAGE和Western blot分析表明,所表达的蛋白为Tat蛋白。结论     ADC患者外周和中枢不同组织部位的HIV-1 tat第一外显子基因所编码的Tat蛋白氨基酸序列存在变异,在原核细胞中对其进行了高效表达,为Tat蛋白的神经毒性研究奠定了基础。     

济南市售小米和玉米中赭曲霉素A污染状况研究

目的 了解济南市售小米和玉米中赭曲霉毒素A的污染情况。方法 采用竞争抑制酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测小米和玉米中赭曲霉毒素A的提取溶剂、检测条件、回收率等,并对其进行优化研究,并利用优化出的条件对济南市5个区市售小米和玉米中赭曲霉毒素A含量进行检测并评价。结果 含有5%氯化钠的60%甲醇水溶液对谷物中赭曲霉毒素A的提取效果较为理想,检测的所有样品中,小米、玉米赭曲霉毒素A检出率分别为41%和38%,其中,超市小米赭曲霉毒素A检出率（56%）明显高于集市小米（26%）(P＜0.05)。赭曲霉毒素A污染水平在0.40～4.45μg/kg之间,中位数为1.67μg/kg, 集市和超市出售的小米、玉米中赭曲霉毒素A污染水平均无统计学意义(P＞0.05)。本次检测所有样品中的赭曲霉毒素A含量均未超过国家规定的粮食中赭曲霉毒素A的限量标准。结论 济南市售的小米和玉米中均不同程度地存在赭曲霉毒素A污染,但污染水平均未超过国家标准。     

当归多糖改善大鼠急性心肌缺血损伤作用的研究

目的:确定当归多糖(ASP)对急性心肌梗死后心肌缺血损伤的作用。方法:在H9c2细胞中建立氧糖剥夺(OGD)的体外缺血模型。运用实时无标记细胞分析技术(RTCA)分析ASP对细胞指数(CI)的影响。采用冠状动脉左前降支结扎术在SD大鼠上建立体内缺血模型,通过HE染色观察不同浓度ASP(100 mg/kg,200 mg/kg,400 mg/kg)对心肌缺血损伤面积的影响。结果:RTCA分析显示:与OGD组相比,ASP干预显著增加心肌CI(P<0.05)。HE染色结果显示:与模型组相比,ASP处理降低了心肌缺血损伤面积,且呈剂量依赖性(P<0.05)。结论:ASP在急性心肌梗死中具有改善心肌缺血损伤程度的作用。     

抗脱氧雪腐镰刀茵烯醇单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备抗脱氧雪腐镰刀茵烯醇(DoN)单克隆抗体(McAb)并对其进行初步鉴定.方法 采用小剂量长周期的免疫方案,以DON-牛血清白蛋白(BSA)偶联物免疫雌性BALB/c小鼠,采用细胞融合的方法制备杂交瘤细胞株,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测上清中McAb,对抗体分泌阳性的细胞株进行克隆化,直至抗体阳性率100%,用竞争抑制ELISA法进一步检测McAb的特异性,腹水诱生法制备大量McAb,并用饱和硫酸铵对其进行纯化,用抗体亚类鉴定试剂盒对该McAb亚类进行鉴定,BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白含量,ELISA检测McAb的滴度、参考工作稀释度和亲和常数.结果 DON-BSA免疫的BALB/c小鼠血清效价为1∶256000,与BSA有强烈的交叉反应.细胞融合后,ELISA筛选抗体分泌阳性的杂交瘤细胞株,经3轮克隆化,建立了1株能稳定分泌抗DON-BSA McAb的杂交瘤细胞株3G5,腹水诱生法制备了大量的McAb.该McAb属IgG1,IgG含量为6.06 g/L,抗体滴度为1∶500000,参考工作稀释度为1∶64 000,抗体亲和常数为1.62×109.用间接竞争抑制ELISA测得校正曲线线性范围9.8～10 000 ng/mL,线性方程Y=-0.272 6X+0.225 9(r=0.930 9).结论 获得了分泌抗DON-McAb的杂交瘤细胞株,该单克隆抗体灵敏度高,特异性强,可用于制备高质量国产DON-ELISA检测试剂盒.     

艾滋病痴呆综合征患者HIV-1 nef基因多样性分析

目的 研究艾滋病痴呆综合征(ADC)患者体内HIV-1 nef基因变异规律,为ADC发病机制的研究提供依据.方法 提取1例ADC病例尸检标本的外周(脾)和中枢神经系统(基底核、额叶灰质、脑膜、颞叶)共5个部位组织中的基因组DNA,PCR扩增HIV-1 nef基因,与pMD19-T克隆载体连接后,蓝白斑筛选挑取阳性菌落测序,序列经BLAST分析后,每个部位取5个序列,利用Bioedit、MEGA4等生物学软件进行基因距离、系统进化树以及同义/非同义替换值(ds/dn)等分析.结果 该ADC患者感染的是HIV-1 B亚型,与标准序列HXB2比较,该病例的HIV-1 nef基因存在变异,且外周组织与中枢神经系统各组织间以及中枢神经组织不同部位的基因变异不同,相同组织来源的nef序列基因距离较小,外周和中枢的nef基因距离差异较大,该病例H IV-1 nef基因在外周和中枢神经系统变异时均受到负向选择压力.结论 ADC患者体内HIV-1 nef基因存在多样性,且不同组织部位的基因变异不同,其导致的Nef蛋白某些氨基酸位点的改变对其生物学活性的影响有待进一步研究.     

HIV-1反式激活蛋白神经毒作用研究进展

人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)感染中枢神经系统,可导致一系列临床并发症,其中最受关注的一种是艾滋病痴呆综合症(AIDS dementia complex,ADC),主要表现为认知损害、精神行为异常和运动障碍.随着高效抗逆转录病毒疗法(highly active anti-retroviral therapy,HAART)的出现,ADC的发病率有所降低,但该疗法并不能完全控制或逆转ADC的发展[1].迄今为止,ADC的发病机制尚不完全清楚.在大脑中,HIV-1主要感染巨噬细胞和胶质细胞,而未感染细胞(如神经元细胞)也能发生损伤和凋亡,表明HIV-1感染细胞后释放的神经毒素对于神经系统的损伤发挥重要作用,其中重要的神经毒素是HIV-1的反式激活蛋白(trans-activator,Tat)[2 -3].本文就Tat蛋白的神经毒性作用机制的研究进展做一综述.     

外泌体的提取、鉴定和保存方法研究进展

外泌体是一种直径介于40～100 nm之间的膜性囊泡,由活体细胞分泌产生,广泛存在于人体各种体液中,富含多种蛋白质和RNA,是细胞间传递生物信息的重要载体,在生理调节和病理发展中都发挥重要作用,是近年来研究的热点。为更深入研究外泌体生物学作用机制,提取高质量的外泌体是首要步骤,基于此,笔者就外泌体的各种提取方法及其优缺点以及鉴定和保存方法的研究进展作如下综述,希望此文能为研究者们提供一些参考,为后续研究打好基础。     

外泌体在疾病实验诊断和临床治疗中的研究进展

外泌体是一种分泌囊泡,广泛分布于血液、尿液等几乎所有体液中,无创易获取,其内包含有丰富的miRNA及蛋白质成分,可敏感的反映来源细胞的生理病理状态,分析外泌体的基因芯片和蛋白质谱可以为疾病筛查和实验诊断提供依据。另外,外泌体在肿瘤治疗方面也具有很好的应用前景。它可用作基因和治疗药物运载的良好载体,靶向运送和抑制肿瘤,也可在人为上调特定分子的表达后增强机体的抗肿瘤免疫,还有被开发成肿瘤疫苗的潜质。该文就血液和尿液来源的外泌体中miRNA和蛋白质组分在人体各个系统疾病实验诊断方面的相关研究以及外泌体在疾病临床治疗尤其是肿瘤治疗中的研究进展作如下综述。     

艾滋病痴呆综合征病人HIV-1tat基因多态性及氨基酸序列分析

目的 研究艾滋病痴呆综合征患者体内HIV-1 tat第一外显子基因序列的特征和变异情况,为艾滋病痴呆综合征发病机制的研究提供依据.方法 提取1例艾滋病痴呆综合征病例尸检标本的外周组织(淋巴结、脾脏)和中枢神经组织(脑膜、额叶灰质、额叶白质、颞叶、基底核)共7个部位的基因组DNA,巢式PCR扩增HIV-1 tat第一外显子基因,与克隆载体pGEM-T连接,经转化、氨苄青霉素和蓝白斑筛选出阳性克隆,每个部位挑取5个菌落测序,测序结果利用BioEdit、MEGA4软件比对并生成系统进化树、计算基因距离和同义/非同义替换值(ds/dn),分析氨基酸位点的改变.结果 该病例感染的病毒是HIV-1 B亚型,分离自不同组织的HIV-1 tat第一外显子基因序列存在差异;与标准序列相比,该病例的HIV-1tat第一外显子基因编码的氨基酸序列有16个位点发生了变异,并且中枢各部位部分氨基酸位点的变异与外周不同,特别是中枢基底核5个序列及颞叶1个序列Q54R的变异值得关注.结论 艾滋病痴呆综合征患者体内,HIV-1 tat第一外显子序列与标准序列存在差异,并且在外周和中枢不同部位中存在的变异不同,这些变异是否与艾滋病痴呆综合征的发病机制有关,还有待进一步研究.

Abstract：

Objective To study the variation and characteristics of HIV-1 tat exon 1 gene from a patient with AIDS dementia complex( ADC), so as to research the pathogenesis of ADC. Methods The tat gene was amplified with nested PCR from genomic DNA which was extracted from lymph node, spleen and different brain tissues( meninges, grey matter from frontal cortex, white matter from frontal cortex, temporal cortex and basal ganglia) of a patient who died of ADC. PCR products were cloned into the pGEM-T vector,after transformation and selection by ampicillin and blue/white spotting. Five of positive clones were sequenced. HIV-1 tat sequences were processed with BioEdit and MEGA4. With the softwares, Neighbor-Joining tree, p-Distances, values of ds/dn, and analysis of amino acid motifs were all done. Results The samples were all identified as HIV-1 B and genetic variation exists in HIV-1 tat isolated from different tissue;Compared with HXB2, sixteen sites of the amino acid seque nce coded by the HIV-1 tat gene which was isolated from the patient changed. In addition, part of the changes were different between periphery and brain,especially, the five Q54R changes from basal ganglia and one Q54R change from temporal cortex are deserve to follow with interest. Conclusion Variations exist in the HIV-1 tat genes extracted from the ADC patient and the variations from peripheral and central nerve tissues were different, whether the variations concerned with the pathogenesis of ADC need more research.