制作胚胎干细胞饲养层细胞条件的优化

背景:研究表明小鼠胚胎成纤维细胞的制作受多种因素的影响.目前对这些因素的研究均建立于半经验的基础上,缺乏客观定量的数据支持.目的:对小鼠胚胎成纤维细胞制作胚胎干细胞饲养层细胞条件进行优化.方法:用两种不同方法从孕13.5 d昆明小鼠胚胎中分离胚胎成纤维细胞,采用锥虫蓝染色计数,比较两种分离方法在细胞活性和数量方面的差异.对分离得到的胚胎成纤维细胞用0.05%胰酶在室温下消化不同时间,分析胰酶消化时间解离贴壁细胞能力和其对细胞活性影响;采用梯度浓度国产丝裂霉素灭活饲养层细胞2 h和2.5 h并制作细胞生长曲线,探索丝裂霉索最佳浓度和处理时间;通过不同冻存方法比较复苏后胚胎成纤维细胞活性,筛选出适合小鼠胚胎成纤维细胞最佳冻存方法.结果与结论:胚胎成纤维细胞对胰酶极其敏感,短时间多次消化法方法显著提高细胞活性和数量;室温下4～6 min胰酶消化时间有利于保存细胞活性:10 mg/L 2.5 h和20 mg/L 2 h丝裂霉素灭活适合制作饲养层细胞;程序性降温使细胞更能适应温度变化,显著提高解冻后细胞活性和数量.     

Dnmt1,Dnmt3a,Dnmt3b和HMT在不同结肠癌细胞系的表达及意义

目的:探讨不同结肠癌细胞系中表观遗传学酶谱的表达水平.方法:RT-PCR分别检测结肠癌细胞系HT-29、Lovo和Caco-2中Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b和HMT mRNA表达水平.结果:Dnmt3b mRNA在结肠癌细胞系HT-29、Lovo中高度表达,Dnmt1与HMT次之,Dnmt3a表达水平最低;Dnmt3b、Dnmt3a在不同结肠癌细胞系之间的表达水平存在显著的差异.结论:不同分化程度的结肠癌细胞系可能存在不同的表现遗传学发生机制;Dnmt3b在建立和维持结肠癌细胞系DNA甲基化模式中可能起更为重要的角色.     

雌激素受体β过表达对大肠癌细胞增殖凋亡的影响

目的观察雌激素受体β（ERβ）过表达对大肠癌细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其机制。方法以脂质体介导的ERβ基因转染SW480细胞,G418筛选阳性克隆（SW480-C1-ERβ）。RT—PCR及WesternBlot鉴定ERβ的过表达。以正常SW480细胞和转染了空质粒的SW480细胞（SW480-pEGFP—C1）作为对照,在无雌激素或有雌激素作用的条件下,采用MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡率,实时荧光定量RT—PCR方法检测凋亡相关基因survivin和Bax表达。结果SW480和SW480-pEGFP—C1细胞中ERβ mRNA和蛋白表达较低,而稳定转染的SW480-C1-ERβ细胞中ERβmRNA和蛋白表达明显增加。在有或无雌激素作用的条件下均可发现,与SW480细胞或SW480-pEGFP—C1细胞比较,SW480-C1-ERβ细胞增殖速度减慢,凋亡率明显增高,survivin表达减低,Bax表达增高;在SW480-C1-ERβ细胞中,有雌激素作用者较无雌激素作用者以上变化更明显。结论ERβ过表达可以同时以配体非依赖性和配体依赖性的方式抑制细胞增殖和增加细胞凋亡,可能与调控凋亡相关基因survivin和Bax表达有关。     

XELOX方案治疗晚期胃癌疗效及安全性观察

目的：研究奥沙利铂联合卡培他滨（XELOX方案）治疗晚期胃癌的疗效及安全性。方法：对无法行手术治疗的45例晚期胃癌行XELOX方案化疗,观察化疗疗效及不良反应,对比化疗前后生存质量改变。结果：XELOX方案治疗晚期胃癌有效率为55.6%,相关不良反应为胃肠道反应（71.1%）、骨髓抑制（44.4%）、肝肾功能损害（31.1%）和神经毒性（22.2%）。本组晚期胃癌患者化疗后生理状况和情感状况评分均显著低于化疗前（均P〈0.05）,社会/家庭状况和功能状况评分均显著高于化疗前（均P〈0.05）。结论：XELOX方案治疗晚期胃癌有效率高,不良反应可耐受,可显著改善生存质量。     

Epigenetic Regulation of the ERβ Gene on the Estrogen Signal Transfection Pathway in Colon Cancer Cells

We studied the regulatory effects of the estragen receptorβ(ERβ)gene on the downstream estrogen signal transfection pathway in colon cancer cells and the possible mechanisms involved.A human ERβ gene recombinant expression plasmid,pEGFP-C1-ERβ,was constructed and transfected into the Caco-2 colon cancer cell line,a line with low ERβ gene expression.The expression of ERβ mRNA and protein was detected 72h after transfection.RT-PCR was used to examine the expression levels of the progesterone recepror(PR)gene ...     

一种新的基因灭活工具——甲基化寡核苷酸技术

后基因组时代的分子生物学研究重点转向了基因功能的研究.基因功能研究中涉及到对过度表达的基因进行抑制或者灭活.本文简要回顾和评价了基因敲除、反义寡核苷酸技术和RNA干扰技术等常用的基因灭活工具,着重对有可能成为第四代基因灭活工具的甲基化寡核苷酸技术,从产生背景、作用机制、技术路线、应用现状及前景等方面进行了详细的论述。以期引起注意和重视.     

结直肠癌相关基因甲基化研究现状和进展

目的：回顾和总结国内外对结直肠癌相关基因甲基化异常改变的研究及其进展。方法：应用Medline及CNKI期刊全文数据库检索系统，以“结直肠癌、甲基化以及结直肠癌相关基因（如K-ras、p53、c-myc、APC、p16、RASSF1A、hMLH1和ERβ）”等为关键词，检索197901～2008—01结直肠癌相关基因甲基化研究的相关文献。纳入标准：1）结直肠癌与甲基化异常改变；2）结直肠癌相关基因。最后纳入35篇文献。结果：在结直肠癌组织中，K-ras和p53基因的异常改变以点突变为主；c-myc基因局部低甲基化是结直肠癌发生中的早期事件，与细胞增殖密切；APC基因除了杂合性丢失（LOH）致失活外，启动子异常高甲基化致失活也很常见；结直肠癌组织呈现一个不定的甲基化分布密度（所有CpG岛中甲基化CV-G占的比例）则可能是p16基因启动子甲基化模式在体内的特征；RASSF1A基因主要因启动子甲基化而失活；hMLH1失活引起MSI（＋）表型可能与右侧散发性结肠癌的分期有密切的关系；ERβ甲基化模式的分析对判断肿瘤预后有价值。结论：因不同基因而异，除了DNA点突变、缺失、插入和重排等遗传学改变外，甲基化等表观遗传学改变在结直肠癌发生中也占重要地位；甲基化研究对结直肠癌的防治将起到积极的探索意义。     

区域胆管、肝动脉、门静脉联合阻断治疗肝内胆管良性疾病的初步应用

目的探讨区域胆管和供应血管联合阻断在难治性肝内胆管疾病治疗中的价值。方法2007年3月～2010年5月对17例右肝内胆管结石、7例肝内型先天性胆管囊肿开展区域胆管和供应血管阻断治疗。对肝内胆管结石行肝内胆管切开取石、胆管注入封闭胶和区域胆管、肝动脉、门静脉阻断;对肝内型胆管囊肿经肝门分离病变胆管开口注入封闭胶后行区域动脉、门静脉、胆管阻断。所有患者术后3d、1周、2周复查肝功能,术后2周、1月、6月、1年行肝脏B超或CT随访。结果所有病例无肝衰、大出血、胆漏、严重感染等严重围手术期并发症;术后2周行肝脏B超或CT检查示病灶明显缩小或消失;术后1月和6月复查肝脏CT示病灶完全消失,病灶所在肝脏萎缩消失,残余肝脏代偿增生。结论通过病变区域胆管、肝动脉、门静脉联合阻断治疗某些难治性区域性良性肝内胆管疾病,可以达到较彻底的治疗效果,且能有效降低对患者的创伤,减少围手术期严重并发症的发生,明显提高该类患者的手术安全性。     

c-myc靶向siRNA真核表达载体的构建和鉴定

目的：设计构建重组体为转染肿瘤细胞，观察癌基因的沉默效果，为探索肿瘤基因治疗的新途径打好基础。方法：以c-myc为靶基因，以pEGFP-C1／U6质粒为载体，设计构建重组体，根据c-myc癌基因cDNA序列，设计有小发夹结构的3条寡核苷酸序列，克隆到空载体pEGFP-C1／U6中，转化DHSa菌株，提取质粒，进行酶切鉴定和测序分析。结果：经酶切鉴定筛出的重组体测序结果与目的序列相同，重组载体构建成功。结论：利用RNAi技术可成功构建小干扰RNA重组体。     

5-氮杂胞苷对RASSF1去甲基化与胃癌细胞增殖和凋亡的关系

目的：探讨5-氮杂胞苷对RASSF1基因去甲基化与胃癌细胞增殖和凋亡的关系。方法将SGC7901胃癌细胞分为AZA组（5-氮杂胞苷处理）和CON组（未用5-氮杂胞苷处理）,比较两组细胞RASSF1基因启动子甲基化、基因表达、细胞周期和凋亡的差异。结果 CON组SGC7901胃癌细胞RASSF1基因启动子MSP处于甲基化状态,AZA组胃癌细胞未检测到甲基化,AZA组RASSF1基因mRNA和蛋白质表达水平高于CON组细胞。AZA组SGC7901胃癌细胞G0/G1期和凋亡率高于CON组细胞（P〈0.05）,S期、G2/M期和PI低于CON组细胞（P〈0.05）。结论5-氮杂胞苷可逆转胃癌细胞RASSF1基因启动子甲基化状态,使沉默的RASSF1基因重新获得表达而抑制胃癌细胞的增殖并促进其凋亡。