TNF-α和CRT双信号对RA患者滑膜组织NLRP3炎症小体的活化作用

目的研究肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和钙网织蛋白(CRT)双信号对类风湿性关节炎(RA)患者成纤维样滑膜细胞(FLS)中核苷酸结合寡聚化结构域受体3(NLRP3)炎症小体活化的影响。方法采用间接免疫荧光染色法检测12例RA和10例骨性关节炎(OA)患者滑膜组织NLRP3、衔接蛋白凋亡相关斑点样蛋白(ASC)的表达,并与滑膜衬里层和衬里下层FLS标志物进行共定位研究。采用胶原酶消化法分离RA患者滑膜组织中FLS并进行体外培养。分别用不同浓度的TNF-α或脂多糖(LPS)(刺激剂)处理细胞,采用免疫印迹法和实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测细胞NLRP3、白细胞介素1β前体(pro-IL-1β)和白细胞介素18前体(pro-IL-18)的蛋白和mRNA表达。加入尼日利亚菌素(Nigericin)或CRT后采用免疫印迹法检测FLS中半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶1(Caspase-1)活化片段p20的表达;收集细胞培养上清液,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测分泌型白细胞介素(IL)-1β和IL-18水平。结果 RA患者滑膜组织中NLRP3炎症小体的主要成分NLRP3和ASC的平均荧光强度高于OA患者(P<0.01)。NLRP3、ASC和IL-1β裂解片段(cleaved IL-1β)与RA患者滑膜衬里层FLS表面标志物PDPN和衬里下层FLS表面标志物CD248均有共定位。体外细胞实验结果显示TNF-α可以促进FLS中NLRP3和pro-IL-1β的蛋白表达;与对照组(无刺激剂)相比,二者的mRNA表达显著增加(P<0.05、P<0.001),而LPS对RA患者FLS中NLRP3炎症小体的预活化无影响。TNF-α/Nigericin或TNF-α/CRT双信号能够促进FLS中Caspase-1的活化,导致Caspase-1活化片段p20呈浓度依赖性升高;与对照组相比,TNF-α/CRT组分泌型IL-1β显著升高(P<0.05)。结论 TNF-α/CRT双信号可促进RA患者FLS中NLRP3炎症小体的活化。