热变性对血细胞流式细胞术分析结果的影响

目的 初步探讨热变性对外周血细胞在流式细胞术分析结果中的影响,从而提高流式-荧光原位杂交（Flow-FISH）技术的应用.方法 收集5例非骨髓造血干细胞疾病患者肝素抗凝外周血标本,以CD45-Alexa Fluor（R）647标记细胞表面抗原,高温变性后,采用流式细胞术分析热变性前后外周血有核细胞的散射光信号和荧光信号变化.结果 热变性后,外周血粒细胞的侧向散射光明显缩小;单核细胞不易通过散射光被区分和设门.所有细胞CD45表达强度均减弱,以淋巴细胞为著;通过侧向散射光和CD45设门虽能大致区分各群细胞,但不及未热变性细胞清晰.结论 热变性后,外周血细胞在流式细胞术中的散射光信号和荧光信号均发生了变化,按照常规FSC/SSC和CD45/SSC方法设门进行细胞亚群分析的结果不精确,利用系列特异性荧光抗体标记是一种有前景的方法.     

人急性淋巴母细胞白血病细胞株Molt-4遗传学特性的研究

本研究探讨人急性淋巴母细胞白血病细胞株Molt-4的遗传学特性,评价其在Flow—FISH方法检测细胞端粒长度中的应用价值。悬浮培养Molt-4细胞并进行规律传代,选取8代不同代数、处于对数生长期的Molt-4细胞进行研究。应用细胞计数法描绘细胞生长曲线并计算细胞倍增时间,流式细胞术检测细胞DNA倍体指数,常规G显带进行染色体核型分析,Southernblot检测细胞端粒长度。结果显示：Molt-4细胞的倍增时间为（1．315±0．062）d、DNA倍体指数为（2．085±0．0093）、端粒长度为（32．05±5．27）kb,不同代数之间无显著性差异（P值分别为0．931、0．888和0．935）。染色体核型分析结果显示,Molt-4细胞染色体数量为91—99条,多数为超四倍体,并且具有稳定的、特征性染色体结构异常。结论：Molt-4细胞具有稳定的遗传特性和较长的端粒长度,可作为Flow—HSH的内对照细胞。     

热变性对外周血细胞亚群标记效果的影响

目的探讨热变性对外周血细胞亚群标记效果的影响,从而建立稳定的流式-荧光原位杂交技术流程（flow cytometryfluorescence in situ hybridization,Flow-FISH）。方法采集10例健康人肝素抗凝新鲜外周血标本,分别以Alexa Fluor647标记的CD3、CD19、CD14抗体标记T淋巴细胞、B淋巴细胞和单核细胞,高温变性后,采用流式细胞术分析热变性前后细胞系列特异性抗原表达的变化;以Fluor647-CD3标记外周血T淋巴细胞,以4种浓度的Bis[sulfosuccinimidyl]suberate（BS3）交联剂进行抗原抗体交联,比较不同浓度BS3的交联效果。结果高温变性后,Alexa Fluor647标记的CD3和CD19的荧光强度减弱,但仍能有效区分出T淋巴细胞和B淋巴细胞;Alexa Fluor647-CD14的荧光强度无变化,单核细胞清晰可辨;4种浓度交联剂BS3作用后,CD3的标记效果基本一致。结论经过热变性后,Alexa Fluor647标记的CD3、CD19、CD14抗体仍能够有效标记出血细胞中的不同细胞亚群,耐热性好,可以用于Flow-FISH技术中;交联剂BS3的适宜作用浓度为2.5 mmol/L。     

流式-荧光原位杂交技术在骨髓增生异常综合征患者骨髓CD34＋细胞相对端粒长度检测中的应用

本研究旨在初步探讨流式-荧光原位杂交（Flow-FISH）技术在骨髓增生异常综合征（MDS）患者骨髓细胞亚群端粒长度测定中的可行性.7例初治低危MDS患者为实验组,7例年龄、性别匹配的营养性贫血患者为对照组.收集肝素抗凝骨髓,以Molt-4细胞株为内对照细胞,以CD34-Alexa Fluor（R）647标记细胞表面抗原,高温变性DNA后与FITC标记端粒探针进行荧光原位杂交,DNA复染后,采用四色流式细胞术检测骨髓有核细胞和CD34＋细胞的相对端粒长度（RTL）.结果显示：实验组和对照组骨髓有核细胞经变性、杂交后,可进行细胞亚群的端粒长度检测.检测结果显示MDS患者骨髓CD34＋细胞RTL显著短于骨髓有核细胞（P =0.001）;与对照组相比,MDS患者骨髓有核细胞RTL及CD34＋细胞RTL均显著缩短（P分别为0.020和0.002）.结论：通过耐热荧光抗体对特定细胞进行标记,Flow-FISH技术可用于细胞亚群RTL检测,值得进一步探索.