表皮葡萄球菌mscL 基因突变株的构建及其生物学功能

目的初步探讨表皮葡萄球菌mscL 基因的生物学功能。方法构建含有壮观霉素抗性基因（spc）的同源重组质粒
pMAD-ΔmscL,电转入表皮葡萄球菌1457,在42 ℃条件下振荡培养,利用蓝白斑和抗生素抗性筛选表皮葡萄球菌mscL基因敲除
突变株（SE1457-ΔmscL）。通过检测低渗胁迫前后突变株和野生株D600值及CFU的变化观察mscL基因对渗透压的调节作用。
采用微量板半定量方法检测不同条件下mscL 敲除突变对细菌生物膜形成的影响。结果成功构建同源重组质粒pMAD-
ΔmscL,经PCR扩增和测序验证获得了表皮葡萄球菌mscL基因敲除突变株,并通过RT-PCR在转录水平上得到进一步验证。处
于对数生长期的mscL突变株在低渗胁迫下的生存能力显著降低,但其生物膜形成能力与野生株相比无显著差异。结论表皮
葡萄球菌mscL基因可在对数生长期参与渗透压的调节,但对生物膜的形成无影响。
     

抑制性消减杂交技术检测反式二羟环氧苯并芘转化细胞与正常细胞基因表达差异

目的　筛选 7,8 二羟 9,10 环氧苯并芘 (BPDE)转化细胞与正常细胞的基因表达差异。方法　以BPDE转化支气管上皮细胞 (16HBE)细胞为检测子 (tester) ,正常 16HBE细胞为驱动子 (driver) ,应用抑制性消减杂交方法构建cDNA消减文库 ,经 2次消减杂交和 2次PCR后 ,将巢式PCR产物插入TA载体克隆 ,随机挑选克隆进行鉴定和测序 ,并用斑点杂交法验证其同源性 ,将所得序列进行GenBank的BLAST分析。结果　发现了 7个在BPDE转化细胞中高表达的基因 ,为翻译延长因子 1α1、线粒体基因、溶解物载体家族 2 5、EphA2、酪氨酸 3 加单氧酶 色氨酸 - 5 -加单氧酶活化蛋白、乳酸脱氢酶A、TRIM2 8等 ,尚有一条在GenBank的已知基因中找不到对应序列 ,在EST序列中找到全长对应序列。结论　发现的高表达基因可能在BPDE的致癌机制中起作用 ,另外 ,可能有未知基因与BPDE的恶性转化作用有关。     

层粘连蛋白受体基因表达谱分析

目的 探讨层粘连蛋白受体（67LR1）基因相关的一组基因表达变化，为反式二羟环氧苯并芘致癌机制的研究提供依据。方法 构建67LR1转基因表达载体，转染人支气管上皮细胞（16HBE），获得转基因67LR1的瞬时表达的细胞株。用半定量RT-PCR方法分析转基因表达产物，应用含8064个基因点的微芯公司基因表达谱芯片CSC-GE-80与双荧光标记样品与芯片杂交和扫描、图像数据分析等一系列处理进行表达谱分析。结果 成功构建出瞬时表达67LR1的细胞株。基因表达谱分析，2组相比发生了显著性表达变化的基因有295个，其中表现为上调的基因有145个，下调表达的基因有150个。在发生了显著性表达改变的基因中，比较有明显功能分类特征的包括与信号转导相关的基因，与肿瘤相关的基因，与免疫反应相关的基因以及与蛋白质合成系统相关的基因等。结论 67LR1基因功能涉及到信号转导、肿瘤相关基因等方面，相关基因的表达变化具有复杂性。     

反式二羟环氧苯(a)芘相关新基因brg的全长克隆

背景与目的:在前期研究中发现,16HBE-C细胞表达变化的基因中有未知基因参与,因其与BPDE有关,所以命名为brg(anti-BPDE related gene)基因.本研究应用cDNA末端快速扩增法(rapid amplification of cDNA ends,RACE)扩增此未知基因的全长,以进行下一步的基因功能研究.材料与方法:应用cDNA末端快速扩增法(RACE技术),对3'和5'端分别设计了梯度PCR,巢式PCR等优化程序,以获得特异的产物,然后对特异产物直接测序,将测序结果进行生物信息学分析,基因拼接等获得新基因brg全长.结果:3'和5'端均成功获得特异性产物,3'RACE测序为394 bp,有明显的PolyA加尾信号,有编码区的终止密码子;5'RACE测序为1 017bp,有起始密码子ATG,其中197 bp为3'和5'全长共有序列.将3'和5'序列拼接,结果全长1 214 bp,生物信息学分析brg基因阅读框1 032 bp,编码344个氨基酸.结论:所得结果与设计一致,说明所采用的技术路线是简便可行的,brg基因可能在反式二羟环氧苯并(a)芘的致癌机制中起重要作用.     

脑梗死患者血清高半胱氨酸检测的初步应用

摘要：目的:观察脑梗死患者血清高半胱氨酸（Hcy）水平的变化,探讨Hcy与脑梗死的关系。 方法:检测138例脑梗死患者和115例非脑梗死患者（其中相关疾病对照组46例,健康人对照组69例）血清Hcy含量,并评价其诊断脑梗死的性能。 结果:脑梗死组有101例（73.2%）患有高血压,相关疾病对照组有21例（45.7%）患有高血压,差异有统计学意义（P<0.01）。脑梗死组血清Hcy的中位浓度为12.60 μmol/L,相关疾病对照组为10.35 μmol/L,健康人对照组为8.20 μmol/L,差异有统计学意义（P<0.01）。当Hcy以10.7 μmol/L为临界值,其诊断脑梗死的敏感性为75%,特异性为74%。 结论:血清Hcy水平增高与脑梗死的发生有密切关系,Hcy的常规检测有望用于脑梗死的预测。     

南京地区住院儿童副流感病毒感染监测

目的监测南京地区儿童急性呼吸道副流感病毒感染的特征,了解副流感病毒流行情况,为临床诊治提供依据。方法采集2009年3月至2012年2月住院的急性呼吸道感染患儿7830例鼻咽分泌物,用直接免疫荧光法检测呼吸道病毒,包括副流感病毒1、2及3型抗原(HPIV1、2、3)等。结果 7830份标本中呼吸道病毒检出最高为呼吸道合胞病毒(RSV),达2 527例(占32.27%)。副流感病毒病原检测阳性776例(总阳性率为9.91%),其中以副流感病毒3型为主,达504例,占副流感病毒检测阳性的64.95%;副流感病毒2型感染最少,仅44例占5.67%。副流感病毒检出率在婴儿组和幼儿组较高,分别为366例(46.86%)和249例(31.88%);春季检出率最高;所致疾病中以支气管肺炎最为多见。结论南京地区住院儿童副流感病毒感染以HPIV3为主,婴儿感染率较高,儿童HPIV1、HPIV3病毒感染好发于春夏季节,HPIV2散发感染。     

表皮葡萄球菌serp2169基因敲除突变株的构建及其生长变化

目的 探讨表皮葡萄球菌serp2169基因敲除对其生物学功能的影响。方法 构建含有壮观霉素抗性基因(spc)的同源重组质粒pMAD- serp2169,电转入表皮葡萄球菌1457株,在42 ℃条件下振摇培养,利用蓝白斑和抗生素抗性筛选表皮葡萄球菌serp2169基因敲除突变株(SE1457-Δserp2169),通过检测OD₆₀₀值观察其生长曲线的变化,同时检测其培养液的pH值,微量板半定量方法检测serp2169敲除突变对细菌生物膜形成的影响。结果 成功构建同源重组质粒pMAD- serp2169。经PCR扩增和测序验证获得了表皮葡萄球菌serp2169基因敲除突变株。serp2169突变株与野生株的生长曲线在平台期出现了差异,野生株有一个二次生长的过程,而突变株则没有。两株细菌形成生物膜的能力无显著差异。结论 表皮葡萄球菌serp2169基因可调控平台期细菌的生长,但对生物膜的形成无影响。     

反式二羟环氧苯并芘诱导人支气管上皮细胞翻译延长因子1α1基因的表达

目的探讨反式二羟环氧苯并芘(反式-BPDE)诱导转化(16 HBE-T)与成瘤(16 HBE-C)人支气管上皮细胞(16 HBE)翻译延长因子1α1基因的表达变化.方法联合应用抑制性消减杂交、生物信息学分析以及半定量RT-PCR等方法,分别以16HBE-T和16HBE-C细胞cDNA为检测子,以正常16HBE细胞(16HBE-N)cDNA为驱动子,构建消减杂交文库,经2次杂交和2次PCR后,插入TA克隆载体克隆,经筛选、测序、序列分析后,设计特异引物,以β-肌动蛋白(β-actin)为内参照,进行半定量PCR.结果有9条差异表达片段与Genbank的翻译延长因子1α1的不同片段相同,半定量PCR表明,翻译延长因子1α1在16 HBE-T和16 HBE-C细胞中的表达水平分别为16 HBE-N细胞的1.148倍和1.253倍,表明表达水平上调.结论翻译延长因子1α1可能与反式-BPDE的转化及成瘤有部分关系.     

二羟环氧苯并芘诱导转化与翻译延长因子的关系

目的探讨真核翻译延长因子1α1(eTEF1α1)基因在反式二羟环氧苯并芘致癌机制中所起的作用。方法采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增真核翻译延长因子1α1基因全长,插入pcDNATM3.1 D irectional TOPO表达载体,以脂质体转染介导的技术和G418细胞筛选法转染人支气管上皮细胞,构建转基因稳定表达的细胞株。用半定量RT-PCR方法分析转基因表达产物,对转基因细胞株,进行双层软琼脂试验以确定基因的恶性特性。结果成功扩增出eTEF1α1基因全长,构建出稳定表达真核翻译延长因子1α1基因的细胞株。稳定转染eTEF1α1基因的细胞株,能在双层软琼脂中形成克隆。结论真核翻译延长因子1α1基因与反式二羟环氧苯并芘的恶性转化有关。