三种抗生素的抗菌活性及角膜上皮细胞毒性比较

目的比较左氧氟沙星、加替沙星和莫西沙星的抗菌活性及对角膜上皮细胞的毒性作用。方法细菌与细胞共孵育1h后,抗生素处理1h,行荧光染色和CFU计数;MTT法和划痕法检测细胞的增生和迁移能力,评价3种抗生素的细胞毒性作用。结果 3种抗生素的抗菌效果均非常显著,其中莫西沙星对金黄色葡萄球菌和左氧氟沙星对绿脓杆菌的抑菌活性最强,对凝固酶阴性葡萄球菌和黏质沙雷菌的抗菌效果差异无统计学意义;在质量浓度低于125mg/L时,左氧氟沙星的毒性明显低于莫西沙星和加替沙星。结论莫西沙星、左氧氟沙星和加替沙星3种抗生素在抗菌活性和上皮细胞毒性方面存在一定差异。     

盐酸倍他洛尔-蒙脱石脂质体的制备与性能考察

目的:优化盐酸倍他洛尔-蒙脱石脂质体(Mt-BH-LP)的处方及制备工艺,考察其体外释放性能和渗透性能。方法:采用乙醇注入法-硫酸铵梯度法制备Mt-BH-LP;以包封率和载药量为评价指标,采用正交试验优化Mt-BH-LP的处方;通过透析法考察Mt-BH-LP的体外释放性能;以家兔离体角膜为模型,采用体外改良的Franz扩散池法研究Mt-BH-LP的渗透性,以人永生化角膜上皮细胞(i HCEC)为模型,研究Mt-BH-LP的渗透性。结果:Mt-BH-LP处方工艺条件为卵磷脂-BH(5∶1),卵磷脂-胆固醇(9∶1),硫酸铵浓度0.15 mol·L~(-1),卵磷脂质量225 mg。Mt-BH-LP包封率(75.85±2.15)%,载药量(11.41±0.29)%,平均粒径(218±22.32)nm,Zeta电位(17.03±0.25)m V;体外释放试验表明Mt-BH-LP在10 h累计释放度达到60.2%,离体角膜透过试验结果表明Mt-BH-LP的角膜水化值[(76.72±2.68)%]在正常范围内。结论:采用乙醇注入法-硫酸铵梯度法制备的Mt-BH-LP包封率和载药量较高,缓释性能良好,具有良好的开发与应用前景。     

高氧诱导小鼠视网膜新生血管模型中端粒酶逆转录酶的表达变化

目的 研究高氧诱导视网膜新生血管模型中小鼠端粒酶逆转录酶(TERT)基因表达水平是否有变化,为进一步研究视网膜新生血管疾病的预防和治疗提供新的靶点.方法 实验研究.选取7 d龄C57BL/6J新生小鼠32只,分高氧组和对照组,每组16只.高氧组小鼠以密闭氧箱内以75%±2%氧浓度饲养5 d后置于正常氧浓度环境中,正常对照组小鼠于正常氧环境中饲养.于小鼠生后12、14及19 d时分别取高氧组和对照组小鼠各2只(4只眼),经尾静脉行2%伊文思蓝溶液灌注并做视网膜铺片,荧光显微镜下观察视网膜新生血管的形成情况.高氧模型组和正常对照组生后19 d幼鼠3只,行HE染色,光学显微镜下观察视网膜血管形态,观察突破内界膜的内皮细胞核数.取生后19 d高氧组和对照组小鼠,分别取其视网膜组织并提取总RNA,反转录成cDNA后行反转录PCR,2%琼脂糖凝胶电泳并照相.提取视网膜总RNA,反转录成cDNA后(同RT-PCR),配制荧光定量实时PCR反应体系(总计20μl),在60℃检测荧光信号,分析图像.分别取高氧模型组和正常对照组P19小鼠行眼球切片,常规处理后TERT抗体孵育37℃ 60 min,HRP酶标二抗孵育30 min,DAB显色,中性胶封片,镜下观察并照相.结果高氧诱导模型小鼠牛后12 d眼底后极部出现大片无灌注区,生后14 d眼底后极部出现新牛血管迂曲、渗漏等视网膜血管病变.生后17～19 d视网膜新生血管形成达到高峰.正常小鼠视网膜组织切片HE染色基本看不剑突出内界膜的血管芽及血管管腔,内界膜下视网膜内的血管内皮细胞核散在分布、数量较少;高氧组见大量突出内界膜伸向玻璃体腔的血管管腔及血管芽,内界膜下视网膜内也有大量血管内皮细胞增生.19 d高氧模型组小鼠视网膜TERT及bFGF mRNA表达较同日龄正常对照组小鼠明显提高,二者差异有统计学意义(F=8.575,5.667;P＜0.05).生后19 d实时PCR检测高氧模型组小鼠视网膜TERT mRNA表达较同日龄正常对照组小鼠明显上调,差异有统计学意义(F=173.104,P＜0.05).生后19 d高氧诱导小鼠视网膜新生血管模型中视网膜新生血管TERT表达阳性,同日龄对照组新生小鼠视网膜血管TERT表达阴性.结论高氧诱导视网膜新生血管小鼠模型中端粒酶逆转录酶和新生血管形成相关因子表达水平明显上调,可能会成为视网膜新生血管疾病预防和治疗的新靶点.(中华眼科杂志,2009,45:199-205)     

白细胞介素-6对糖尿病小鼠角膜缘干细胞活化的促进作用和角膜上皮愈合的加速作用

背景 白细胞介素(IL)-6既介导炎症反应过程又在损伤修复中发挥重要作用,但其具体机制及其在糖尿病角膜组织损伤修复中的作用值得探讨. 目的 探讨IL-6在正常和糖尿病小鼠角膜缘干细胞活化和角膜上皮修复过程中的作用及其机制.方法 正常6～8周龄C57B L/6小鼠52只,采用随机数字表法随机分为正常对照鼠32只和糖尿病模型鼠20只,采用50 mg/kg链脲佐菌素连续腹腔内注射5d的方法诱导建立小鼠糖尿病模型.正常对照小鼠和糖尿病模型小鼠均行角膜上皮刮除术,然后分别于刮除后即刻和48 h结膜下注射IL-6或等容量PBS,采用荧光素染色法评价随时间延长的角膜上皮的愈合情况.体外培养小鼠角膜上皮干/祖细胞(TKE2细胞系),采用结晶紫染色法评估不同质量浓度IL-6处理后细胞克隆率(CFE),并与空白对照组进行比较;采用免疫荧光检测法和Western blot法检测细胞和小鼠再生上皮中干细胞标志物△NP63、Ki67的表达以及关键转录因子STAT3磷酸化水平;采用实时荧光定量PCR法和ELISA法检测小鼠角膜再生上皮中IL-6的mRNA及蛋白水平.结果 角膜荧光素染色检查显示,正常对照小鼠和糖尿病模型小鼠PBS注射组与IL-6注射组注射后24、48和72 h残留角膜上皮缺损面积占原始缺损面积的百分比随角膜上皮损伤后时间延长均明显缩小,同时间点IL-6注射组角膜上皮缺损面积均明显小于PBS注射组,组间总体差异均有统计学意义(正常对照组:F分组=19.982,P＜0.01;F时间=589.350,P＜0.01;糖尿病组:F分组=25.411,P＜0.01;F时间=334.807,P＜0.01).空白对照组及10、20、50、100 ng/ml IL-6处理组CFE分别为(13.23±1.12)％、(15.87±1.30)％、(21.69±1.62)％、(25.33±1.28)％和(18.67±1.54)％,随着IL-6质量浓度的增加CFE逐渐增加,总体比较差异有统计学意义(F=35.547,P＜0.01).50 ng/ml IL-6处理5、10、15、30和60 min细胞中△NP63、Ki67和p-STAT3蛋白的相对表达量随着处理时间的延长均逐渐增加,各时间点细胞中△NP63、Ki67和p-STAT3蛋白的相对表达量均明显高于空白对照组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).糖尿病组和正常对照组小鼠角膜上皮刮除后24 h的再生上皮中IL-6 mRNA相对表达量分别为0.45±0.21和1.00±0.16,糖尿病组小鼠角膜再生上皮中IL-6 mRNA相对表达量较正常对照组小鼠下降56％,差异有统计学意义(t=3.42,P=0.03),糖尿病小鼠角膜上皮刮除后48 h的再生上皮中IL-6蛋白质量浓度为(257±12)ng/μl,明显低于正常对照组小鼠的(323±17) ng/μl,差异有统计学意义(t=5.60,P＜0.01). 结论 IL-6能够通过激活STAT3信号通路促进正常和糖尿病小鼠角膜缘干细胞的活化和增生,进而促进角膜上皮修复,而封闭内源性IL-6则会延迟小鼠角膜上皮的修复.     

干细胞移植与角膜功能重建的研究进展及其存在的问题

近年来,干细胞移植,包括自体或异体角膜缘干细胞、口腔黏膜上皮以及体外培养的干细胞移植进行角膜功能重建的基础研究取得了一些进展,在临床应用中也得到了较好的治疗效果,但对眼表严重损伤的治疗效果、远期治疗评价和移植细胞的体内转归方面仍无定性的结论。对体外培养的干细胞移植重建角膜功能的基础研究和临床应用方面的研究进展进行介绍和比较,并对存在的问题进行讨论。     

血管内皮生长因子及其受体家族在角膜组织及角膜病变中的作用和研究进展

BACKGROUND: Vascular endothelial growth factors are a family of multifunctional cytokines that can enhance vascular permeability, induce angiogenesis, promote endothelial cell growth and migration, and inhibit cell apoptosis. OBJECTIVE: To elaborate the latest progress in the role of vascular endothelial growth factor and its receptors in the corneal tissue. METHODS: A computer-based search of PubMed databases was performed for relevant articles published from 2005 to 2015. The key words were “vascular endothelial growth factor, cornea”. According to the inclusion and exclusion criteria, 43 articles were included in result analysis. RESULTS AND CONCLUSION: Vascular endothelial growth factor and its receptors are involved in the regulation of corneal neovascularization by causing Tip cell activation that affects the Notch signaling pathways. Corneal lymphatic regeneration mainly relies on macrophages to secrete vascular endothelial growth factor-C or vascular endothelial growth factor-D that further activate vascular endothelial growth factor receptor-3 in the lymphatic endothelial cells to cause cell proliferation and migration, and eventually lead to the formation of new lymphatic vessels. But herpes simplex keratitis HSK induces the corneal lymphatic regeneration by vascular endothelial growth factor-A/vascular endothelial growth factor receptor-2 pathway. Vascular endothelial growth factor family can significantly improve the damaged corneal nerve endings, epithelium and corneal sensitivity, has the function of nerve nutrition and promote restoration of the corneal epithelium.       

Slit2对糖尿病模型小鼠角膜上皮和神经的保护作用及其机制

目的:探讨Slit引导配体2(Slit2)对糖尿病小鼠角膜上皮和神经损伤修复的促进作用及其可能的分子机制。方法:选取60只SPF级5~6周龄C57BL/6小鼠,采用随机数字表法分为正常对照组、糖尿病模型组和Slit2注射组,每组20只。糖尿病模型组和Slit2注射组小鼠采用链脲霉素腹腔内注射法建立糖尿病模型。构建小鼠角...     

视网膜色素上皮细胞诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞

目的：检测视网膜色素上皮细胞对骨髓间充质干细胞分化的调节作用。方法：体外培养人骨髓间充质干细胞（BMSC）和视网膜色素上皮（RPE）细胞。RPE细胞采用紫外线照射处理,而后与CFSE标记的BMSC共培养14d。并在共培养体系中加入牛眼视网膜提取物（BRE）以研究视网膜成分对此分化过程的影响。采用NSE,Nestin和GFAP抗体标记检测BMSC分化前后的表达特征。结果：BMSC在与RPE细胞共培养后,能够分化成为神经样细胞,并表达神经性细胞的特异性标记NSE．Nestin和GFAP。BRE能够显著促进共培养体系中BMSC向神经样细胞的分化。结论：RPE和BRE能够诱导BMSC分化为神经样细胞。     

TERT基因siRNA抑制鼠视网膜新生血管形成的研究

目的 探讨小鼠端粒酶逆转录酶(TERT)小分子干扰RNA(siRNA)对小鼠视网膜新生血管形成的抑制作用,及其用于视网膜新生血管疾病治疗的可行性.方法构建TERT siRNA重组质粒pSIREN-mTERT-1和阴性对照质粒pStREN-mTERT-N.选择7 d龄C57BL/6J小鼠80只随机分为基因治疗组、阴性质粒组、高氧对照组及正常对照组,每组20只.前3组置于75%±2%高氧环境中生活5 d,然后回到正常氧环境中.于第12天出氧舱时,分别向基因治疗组、阴性质粒组两组小鼠玻璃体腔内注射上述两种质粒.正常对照组小鼠正常氧环境中饲养.高氧对照组和正常对照组不予玻璃体腔注射.第19天用2%Evens蓝灌注进行视网膜铺片,观察各组小鼠视网膜血管形态变化;反转录-PCR及Real-time PCR检测各组间TERT mRNA和新生血管相关基因的表达变化;组织切片观察并计数突破内界膜的血管内皮细胞数量.对数据采用单因素方差分析进行统计学比较.结果 荧光造影视网膜铺片显示,基因治疗组整个视网膜血管分布网基本正常,走形较自然,基本接近正常对照组,未见明显的新生血管丛及大片荧光渗漏,只在视网膜中周部及周边部见少许荧光渗漏,但较阴性质粒组及高氧对照组明显减少.阴性质粒组及高氧对照组视网膜血管紊乱,中周部血管迂曲,伴大片荧光渗漏.RT-PCR及实时PCR显示基因治疗组小鼠视网膜TERT mRNA表达为0.56±0.32,明显少于阴性质粒组及高氧对照组(P＜0.05).组织切片HE染色观察,基因治疗组仅见1处新生血管芽,偶见突出内界膜的细胞核;阴性质粒组及高氧对照组见散在突出内界膜伸向玻璃体腔的血管芽,内界膜下出现明显的血管内皮细胞增生;光镜下观察突破内界膜新牛血管内皮细胞计数,基因治疗组(14.62±1.70)较阴性质粒组(32.38±7.50)及高氧对照组明显减少,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 TERT特异的siRNA能有效地抑视网膜新生血管动物模鼎视网膜中视网膜新生血管的形成,可能会成为一种治疗视网膜新生血管疾病的新方法.