基于自组装单分子层技术的压电石英晶体DNA传感器固定方法的研究

目的 探讨一种高效的压电石英晶体DNA传感器固定的方法。方法 分别采用常规自组装法（未还原探针法）与探针预先经过还原的自组装法（还原探针法），将针对铜绿假单胞菌的探针固定在DNA传感器的金膜表面，比较不同探针浓度下，探针固定和杂交反应所引起的频率的变化以及所用的时间。结果 与未还原探针法相比，还原探针法具有探针固定量大、反应速度快、频率下降明显等优点。结论 还原探针法提高了DNA探针的固定效率，优于未还原探针法。     

运用压电石英晶体生物传感器检测产气荚膜梭菌α毒素的实验研究

目的研究运用压电石英晶体生物传感器对产气荚膜梭菌α毒素（CPα）进行检测的方法和反应条件。方法按照碱基配对的原则,设计特异的产气荚膜梭菌α毒素基因寡核苷酸探针并利用巯基自组装技术固定在石英晶体上,运用压电石英晶体生物传感器的“质量效应”对聚合酶链反应（PCR）扩增得到的产气荚膜梭菌α毒素靶基因进行杂交检测,并探讨不同pH值和不同离子强度的缓冲液对检测的影响。结果压电石英晶体生物传感器成功检测出产气荚膜梭菌α毒素;pH7.6的缓冲液和0.64mol/L的NaCl溶液最适合于检测。结论压电石英晶体生物传感器能够有效地检测产气荚膜梭菌α毒素,有望对临床上开展毒素诊断提供一种新的手段。     

探针浓度对蛋白质-DNA相互作用新型压电生物传感器的影响

目的 探讨不同探针浓度对蛋白质-DNA相互作用新型压电生物传感器结合效应的影响.方法 将6种不同浓度NF-κB顺式作用元件(DNA)探针通过巯基化法固定在传感器的金膜表面,并与特异性蛋白NF-κB 的p65亚基进行结合反应,通过计算机采集分析传感器频率数据,观察不同浓度探针与p65亚基结合反应所引起的频率变化及反应所需的时间.结果 在DNA顺式作用元件探针浓度为0.25～3.0μmol/L的范围内,随着探针浓度的增加,p65蛋白与DNA探针结合反应所引起的传感器频率变化逐渐增加,当探针浓度为2.0μmol/L时所引起的频率变化与探针浓度为3.0μmol/L所引起的频率变化差异无统计学意义(P>0.05);同时p65蛋白与DNA的结合反应平衡时间随着探针浓度的增加有缩短趋势,当探针浓度为2.0μmol/L时,结合反应平衡时间最短为15min.结论 随着DNA探针浓度的增加,蛋白质-DNA结合反应引起的频率下降呈典型的饱和曲线趋势,探针浓度为2.0μmol/L、反应时间为15min,是蛋白质-DNA相互作用压电生物传感器的最适结合反应条件.     

快速提取细菌DNA方法的研究

目的:研究快速、有效可以应用于压电基因传感器对病原微生物的快速检测的DNA的提取方法。方法:采用沸水浴法,酚、氯仿法,chelex1 0 0法和试剂盒法提取金黄色葡萄球菌ATCC2 5 92 3、铜绿假单胞菌ATCC 2 785 3和大肠杆菌ATCC 2 5 92 2的DNA对产物进行纯度和产量测定,并对1 6SrDNA区域利用通用引物进行扩增。初步应用自行研制的压电基因传感器检测金黄色葡萄球菌ATCC2 5 92 3的PCR产物。结果:除沸水浴法,其他3种方法均能抽提出3种细菌的DNA与1 0 0法和酚、氯仿法抽提产物的纯度和产量差异无显著性(P >0 .0 5 ) ,但chelex1 0 0法操作更为简单、成本低;试剂盒法抽提出的产物纯度和产量明显高于酚、氯仿法、chelex1 0 0法P <0 . 0 5 ) ,但成本高,操作繁琐。结论:chelex1 0 0法操作简便、省时、成本低,适宜用于压电传感器样本的预处理。     

核酸荧光染料在琼脂糖凝胶电泳中的染色特性

目的建立比溴化乙锭(EB)更为安全的核酸染色方法。方法对SYBR Gold,SYBR GreenⅠ,Gold-View和EB等4种核酸荧光染料在琼脂糖凝胶中的染色特性进行比较分析。结果SYBR Gold和SYBR GreenⅠ可改变核酸的电泳迁移率及相应的DNA大小判断,但二者是比EB更为完全和经济的核酸荧光染料;对于小片段DNA,SYBR Gold的灵敏度高于SYBR GreenⅠ。结论SYBR Gold和SYBR GreenⅠ是比EB更为完全和经济的核酸荧光染料,适合于分子生物学实验室的常规应用。     

凝血反应压电频率动态响应规律的研究

目的探讨体外凝血反应引起压电传感器频率变化的规律,建立压电凝血终点判断模型。方法理论分析凝血反应导致反应体系黏度密度变化规律,推导适合的频率动态响应模型并建立新的压电凝血终点判断法;用建立的反应模型检测凝血酶原时间(PT),并删减和延长不同长度的原曲线末段,然后以新方法和既有的最大拟合曲率判断法(MCF)判断终点并比较。结果根据反应体系黏度密度变化规律,理论推导出体外凝血反应过程中压电频率动态响应规律符合F=(f0-?f) 1 ?e(t-ft0)/dt模型;根据该模型建立了新的反S拟合曲线法(ISF);与既有的最大拟合曲率法相比,前者检测速度更快(P<0.01),重复性更好(P<0.01)。结论该反S模型可以较理想地反映凝血反应中压电频率动态变化规律,ISF法可以理想的判断压电凝血终点。     

应用多重PCR鉴定对人致病的产气荚膜梭菌毒素

目的研究用多重PCR的方法鉴定产气荚膜梭菌及分型毒素,为开展基因诊断做好准备。方法根据GenBank已经发表的产气荚膜梭菌毒素基因序列,设计出针对CPα、CPβ、CPE毒素基因的3对特异引物,运用多重PCR的方法鉴定出产气荚膜梭菌并对其毒素基因进行分型。结果经电泳鉴定,多重PCR成功的扩增出预先设计的3条特异的目的条带。结论所设计的多重PCR反应体系能够得到产气荚膜梭菌的特异序列,同时能够鉴定分型3种对人致病的毒素序列,为进一步开展基因诊断打下基础。     

压电凝血反应频率指数衰减规律及最大曲率终点法的研究

目的建立压电凝血反应曲线拟合模型及最大曲率终点法判断反应终点。方法用压电石英传感器检测血浆凝血酶原时间,比较指数衰减、幂函数及多项式3种拟合模型的6种曲线的拟合效果,并采用最大曲率终点法判断反应终点。结果6条拟合曲线的非线性回归效果均有显著意义(P<0.05);同类模型内的两条曲线残差平方和(SSE)比较没有显著性差别(P>0.05),而非同类模型之间则差异显著(P<0.01),且多项式SSE最小,指数衰减模型次之,但多项式模型因其曲率存在多个峰值而不能用最大曲率法判断终点;最大曲率终点法比传统的终点频率峰法重复性更好(P<0.05)。结论指数衰减模型Y=A B×EXP(-X/C)能很好地拟合压电凝血反应曲线;最大曲率终点法能显著提高检测重复性。