重症肌无力抗乙酰胆碱受体单链抗体基因的构建

[目的 ]构建重症肌无力抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因 .[方法 ]应用PCR技术及基因克隆技术分两步完成重链和轻链可变区基因的克隆 ,再对构建的单链抗体A 7基因进行序列测定检测其核苷酸序列 .[结果 ]构建的重组质粒经序列分析 ,重链可变区基因长度为 36 9bp ,轻链可变区基因长度为 32 1bp ,单链抗体基因长度为 735bp ;单链抗体A 7基因正确地插入在载体质粒pHEN 2开放读码框架内 .[结论 ]成功地构建重症肌无力抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因 ,为进一步制备基因工程抗体奠定了基础 .     

抗乙酰胆碱受体单链抗体对致病性抗体结合活性的抑制作用

为探讨单链抗体 (ScFv )对重症肌无力 (MG )的特异性免疫治疗作用 ,从分离自MG患者胸腺的抗乙酰胆碱受体(AchR )抗原结合片段Fab6 37构建单链抗体ScFv6 37。应用放射免疫测定法测定了ScFv6 37与刺激抗原人AchR的特异性结合活性以及与相关抗原大鼠AchR和电鳐AchR的交叉反应 ,应用竞争性ELISA测定抑制致病性抗AchR完整抗体IgG6 37与人AchR结合活性。结果发现ScFv6 37只能与人AchR结合 ,不能与大鼠和电鳐的AchR结合。对IgG6 37与人AchR结合的抑制率为 17 5 %～ 32 9%。表明单链抗体对AchR具有一定的“保护”作用。     

磷酸组织胺诱导的Ⅰ型超敏反应对肝损伤作用的研究

目的:通过观察与Ⅰ型超敏反应相关的生物活性介质--组织胺对家兔肝脏有无直接损伤作用,进一步论证Ⅰ型超敏反应对肝脏的损伤作用.方法:选择34只家兔随机分为对照组、实验Ⅰ组和实验Ⅱ组3组;对照组只进行正常饲料喂养,实验Ⅰ组在正常饲料喂养的同时每天给予0.4μg/kg耳静脉注射磷酸组胺注射液,实验Ⅱ组在正常饲料喂养的同时每天给予0.08 μg/kg耳静脉注射磷酸组胺注射液;动态观察以上3个组的血清谷丙转氨酶(ALT)及血清谷草转氨酶(AST)变化;利用光学显微镜观察以上3个组肝组织的病理变化.结果:无论是实验Ⅰ组或实验Ⅱ组,经过一段时间的观察,发现血清内ALT和AST含量均显着高于对照组(P＜0.01),但Ⅰ、Ⅱ组之间无显着性差异(P＞0.05);实验Ⅰ组和实验Ⅱ组在显微镜下观察,其肝脏均有不同程的损伤和病理改变,且实验Ⅱ组的损伤和变化大于实验Ⅰ组,而对照组的肝脏则无明显的病理变化.结论:组织胺对家兔肝脏确实有一定的损伤作用,而且随着投予剂量和时间的增加,肝脏的损伤和病理变化也越显著;通过本研究,可以得出Ⅰ型超敏反应导致肝脏病理变化及损伤的见解.     

珍珠梅提取物的体内抑瘤作用及其机理研究

目的：探讨珍珠梅醋酸乙酯提取物对S180荷瘤小鼠体内的肿瘤抑制作用及机理。方法：按照标准方法给36只小鼠接种S180肉瘤后，给予珍珠梅提取物10 d，观察瘤重及体重，免疫组织化学方法检测肿瘤组织中的hcl-2和p53蛋白，比色分析法检测血清SOD，GSH-Px的活性及MDA含量的变化。结果：给予珍珠梅醋酸乙酯提取物的小鼠瘤重明显小于对照组，实验组与对照组体重变化无显著性差异：对照组的bcl-2和p53蛋白的表达率明显高于实验组，实验组的SOD，GSH-Px活性高于对照组，而MDA含量低于对照组。结论：珍珠梅醋酸乙酯提取物对小鼠S180肿瘤有抑制作用，并有可能影响bcl-2和P53的表达及清除体内自由基。     

弓形虫病诊断方法研究进展

弓形虫病是由弓形虫感染引起的一种严重的人兽共患寄生虫病,对人类健康造成极大威胁。本文对弓形虫病诊断技术,包括不依赖DNA检测诊断方法、血清学检测以及基于寄生虫核酸的分子生物学方法进行综述,为弓形虫病诊断技术和方法的发展提供新的思路。     

染料木素对乳腺癌细胞睾丸特异性蛋白酶50 表达的影响

目的:阐明低浓度染料木素(Gen)促进乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231癌睾丸抗原特异性蛋白酶50(TSP50)表达的机制。方法:取对数生长期乳腺癌细胞,免疫组化、Western blot法观察乳腺癌细胞中TSP50表达情况,MTT还原法、流式细胞术和双染法检测Gen对乳腺癌细胞周期、凋亡情况及TSP50表达的影响。结果:对照组、5μmol/L Gen和25μmol/L Gen组干细胞亚群阳性率分别为(7.37±0.43)%、(11.57±1.13)%和(12.05±0.96)%;高浓度Gen作用后,干细胞亚群百分率下降(6.04±0.22)%;与对照组相比,5μmol/L Gen和25μmol/L Gen处理后,P70S6K1磷酸化水平略有增加,Erk1/2的磷酸化水平显著增加,MCF-7细胞中MMP-2与TSP50蛋白在5μmol/L浓度下表达增加。结论:低浓度Gen刺激乳腺癌细胞生长,TSP50可因非基因组效应相关的信号而表达增加,使ER~+乳腺癌干细胞表型特异性分子增加,促进ER~+乳腺癌细胞增殖。     

MuSK-mCherry融合荧光蛋白的构建及对重症肌无力患者MuSK抗体的检测

目的：构建肌肉特异性激酶（MuSK）与红色荧光蛋白（mCherry）的重组融合蛋白（MuSK-mCherry）,并作为抗原用于重症肌无力（ MG）患者血清中的MuSK抗体（ MuSKAb）的检测。方法：应用PCR技术,从含有mCherry 基因的载体pRSET-B扩增mCherry基因,经T载体（pGEM-T Easy Vector）克隆至含有MuSK细胞外区第22-452位氨基酸肽段基因的载体pMT/BiP/V5-His（ MuSK）上,构建MuSK-mCherry融合荧光蛋白基因。将重组载体转染果蝇S2细胞,表达产物以共聚焦显微镜检查。以MuSK-mCherry融合蛋白作为抗原,应用荧光免疫沉淀试验检测MG患者MuSKAb。结果：成功地构建了MuSK-mCherry融合蛋白基因,并得到了表达。经对已知MuSKAb阳性的MG患者血清中的MuSKAb的检测证实,构建的MuSK-mCherry融合蛋白在荧光免疫沉淀试验中可以检测到MuSKAb。结论：以MuSK细胞外肽段与mCherry构建的融合荧光蛋白作为抗原,可以用于MG患者血清中的MuSKAb的检测。     

重症肌无力转基因小鼠模型的建立

[目的]建立人免疫球蛋白转基因小鼠实验性自身免疫性重症肌无力模型．[方法]用电鳐电器官分离纯化的乙酰胆碱受体免疫人免疫球蛋白转基因小鼠，以肌肉收缩力判定病情，以放射免疫测定法测定动物血清中抗乙酰胆碱受体抗体滴度及动物全身肌肉乙酰胆碱受体浓度．[结果]实验动物血清中抗乙酰胆碱受体抗体滴度为6～296nmol，全身肌肉乙酰胆碱受体损失率最高达65％，部分动物出现肌肉收缩无力表现．[结论]成功地建立了人免疫球蛋白转基因小鼠实验性自身免疫性重症肌无力模型．     

单链抗体A7基因的原核细胞表达

[目的]制备抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因,为基因治疗重症肌无力奠定基础.[方法]构建含有抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因的重组原核表达载体pHEN 2-单链抗体A 7,将其转化至大肠杆菌HB 2151中,以异丙基--βD-硫代半乳糖苷(IPTG)为诱导剂,在外周质中进行表达,以硼酸钠裂解细菌细胞壁,制备含有单链抗体的裂解液,应用鼠抗c-myc单克隆抗体的斑点杂交试验检测表达的单链抗体A 7基因.[结果]在大肠杆菌的外周质中可见单链抗体A 7基因表达,培养上清液中未见单链抗体A 7基因表达.[结论]抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因在原核细胞成功表达.     

抗乙酰胆碱受体单抗配位特异性和序列分析

测定了２株抗乙酰胆碱受体单抗的配位特异性，发现这２株抗体识别ＡＣｈＲ上同一表位。免疫印迹法证明：这２株抗体辩论ＡＣｈＲ上ｒ和δ亚单位。可变区核苷酸序列分析证实：这２株抗体的Ｈ链同源性为９５．３％，Ｌ链同源性为９５．８％。这２株抗体可能来源于同一前体基因，在抗原刺激的亲和成熟过程中，发生了体细胞突变。