RNAi抑制Layilin表达对肺腺癌A549细胞体外侵袭和荷瘤鼠体内淋巴转移的影响

背景与目的：透明质酸参与了多种肿瘤细胞的侵袭行为，Layilin是一种新发现的特异性透明质酸受体。本研究在发现Layilin表达于人肺腺癌A549细胞株的前期工作基础上，观察用RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术抑制Layilin表达后，对人肺腺癌A549细胞体外侵袭和体内淋巴道转移的影响。方法：构建能表达针对Layilin的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）的RNAi质粒（Layilin siRNA plasmid）和表达不针对任何已知mRNA的siRNA的阴性对照RNAi质粒（control siRNA plasmid），分别转染A549细胞，新霉素抗性筛选得到Layilin表达受抑制的A549-siLayilin细胞和Layilin表达未受影响的A549-siControl细胞。针对非转染（A549-nontransfection）、A549-siLayilin、A549-siControl3组细胞，分别采用RT—Realtime PCR和Western blot技术检测Layilin表达，用Boyden小室实验检测细胞体外侵袭能力，用爪垫皮下种植淋巴结转移模型检测淋巴转移能力。结果：与A549-nontransfection组和A549-siControl组相比，A549-siLayilin组细胞Layilin表达减少，体外侵袭能力降低，体内淋巴转移率下降。结论：通过RNAi抑制Layilin表达后，能有效抑制透明质酸所诱导的A549细胞体外侵袭和裸鼠移植瘤淋巴转移。本研究为通过RNAi手段抑制Layilin表达，进而抑制肺腺癌淋巴转移提供了有益的思路．     

TGFβ1对人肾小管上皮细胞表达糖原合成酶激酶-3β的影响

目的 研究转化生长因子β1(transforming growth factor β1, TGFβ1)对人肾小管上皮细胞株(human kidney proximal tubular epithelial cell line, HKCs)表达糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)的影响.方法 将体外培养的的HKCs随机分为4组:正常对照组(C组):无血清培养基(free serum medium, FSM)培养; Ta组、Tb组和Tc组:用含不同浓度TGFβ1(Ta组:ng/ml,Tb组:0ng/ml,Tc组:0ng/ml)的FSM培养.12h后,分别用RT-PCR、Western blot检测HKCs GSK-3β的mRNA、总蛋白表达量以及蛋白磷酸化水平.结果 (1)GSK-3β mRNA和总蛋白在各组间表达量差异无统计学意义(P＞0.05),和C组相比各T组GSK-3β蛋白磷酸化水平显著升高(P＜0.01);(2)Tb组与Tc组相比,GSK-3β磷酸化水平更高(P＜0.01);(3)Tb组与Tc组相比,GSK-3β磷酸化水平差异无统计学意义(P＞0.05).结论 TGFβ1虽不影响HKCs的GSK-3β mRNA和总蛋白表达量,但能提高GSK-3β蛋白磷酸化水平,后者可能参与TGFβ1诱导的 HKCs转分化过程.     

透明质酸诱导人肺腺癌A549细胞表达血管内皮生长因子-C

目的：研究透明质酸（HA）对体外培养的人肺腺癌A549细胞表达血管内皮生长因子-C（VEGF-C）的影响。方法：体外培养的A549细胞被随机分为三组，对照组：无血清培养基（FSM）培养；HA10ug／ml组和HA20ug／ml组：分别用HA10ug／ml和20ug／ml的FSM培养，48h后，分别用RT-PCR、Westernblot和免疫荧光方法检测A549细胞VEGF-CmRNA和蛋白表达。结果：对照组VEGF-CmRNA和蛋白表达为弱阳性；HA10ug／ml和HA20ug／ml组VEGF-CmRNA和蛋白表达皆呈强阳性。HA20ug／ml组与HA10ug／ml组相比，VEGF-CmRNA和蛋白表达皆显著增加（P〈0．01）。结论：HA能呈剂量依赖性地诱导A549细胞表达VEGF-C。     

CXCR4阳性Lewis肺癌细胞耐药实验研究

目的 研究CXCR4阳性Lewis肺癌细胞(Lewis lung carcinoma,LLC)原发性耐药机制.方法 激光共聚焦检测小鼠移植瘤组织内CXCR4阳性LLC;以CXCR4作为磁珠分选细胞的表面标志,应用CCK-8法检测CXCR4阳性和阴性LLC对顺铂的敏感性,RT-PCR检测两者ABCG2、IGF1R mRNA表达情况.结果 小鼠移植瘤组织内散在分布胞膜呈红色荧光的CXCR4阳性LLC;CXCR4阳性与阴性LLC比较,具有更强的增顺铂抗拒性(P<0.05);CXCR4阳性LLC的ABCG2 mRNA表达(0.5240±0.0078)明显高于CXCR4阴性LLC(0.3870±0.0066) ,相差显著(P<0.01);CXCR4阳性LLC的 IGF1R mRNA表达(0.4209 ±0.0074)明显高于CXCR4阴性LLC(0.1848±0.0066),相差显著(P<0.01).结论 Lewis肺癌细胞中的CXCR4阳性亚群具有更强上调ABCG2、IGF1R表达的能力,具有顺铂抗拒性.     

肝细胞生长因子对人肾小管上皮细胞转分化的影响

目的观察肝细胞生长因子(HGF)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人肾小管上皮细胞(HKC)转分化的影响。方法将体外培养的HKC分为正常组、TGF-β1组、HGF组、TGF-β1 HGF组、延迟加入HGF组。应用间接免疫荧光技术观察HKC中α-SMA蛋白、E-cadherin的表达。用RT-PCR技术检测细胞中α-SMA mRNA的表达。结果免疫荧光技术显示,TGF-β1能诱导HKC表达α-SMA蛋白,减少E-cadhefin表达;同时加入HGF能减少α-SMA蛋白表达,而延迟加入HGF能使部分转分化的HKC细胞恢复E-cadherin的表达。RT-PCR结果显示,正常组无α-SMA mRNA表达,TGF-β1可诱导HKC表达α-SMA mRNA;同时加入HGF后α-SMA mRNA基本无表达,而延迟加入HGF后α-SMA mRNA表达明显下降。结论TGF-β1可诱导肾小管上皮细胞转分化,而HGF能抑制TGF-β1诱导的转分化,延迟加入HGF能使部分发生转分化的肾小管细胞恢复上皮表型。     

Sca-1+Lewis肺癌细胞耐药实验研究

目的 探讨小鼠Lewis肺癌(Lewis lung carcinoma,LLC)细胞株中Sca-1 LLC细胞的耐药特性及机制.方法 将LLC细胞培养于含有不同浓度丝裂霉素、顺铂、健择、紫杉醇的培养液中,培养72h后分别检测各组Sca-1阳性细胞的比例.以Sca-1作为磁珠分选的表面标志,从LLC细胞中分选Sca-1 LLC细胞和Sca-1-LLC细胞,RT-PCR检测各组ABCG2 mRNA表达水平.免疫荧光检测Sca-1 LLC细胞与SP细胞(Hoechst 33342拒染)的关系.结果 随着抗肿瘤药物浓度的升高,Sca-1阳性细胞的比例随之升高.RT-PCR检测表明Sca-1 LLC细胞表达更高水平的ABCG2 mRNA,免疫荧光发现SP细胞只存在于Sca-1 LLC细胞.结论 Sca-1 LLC细胞的耐药性较Sca-1-LLC细胞强,与Sca-1 LLC细胞高表达ABCG2有关.     

miR-223在CXCR4~+Lewis肺癌细胞中的显著低表达及其靶基因预测

目的 分析miR-146a、miR-206、miR-223、let-7c-1等细胞分化相关miRNAs,在小鼠Lewis肺癌细胞株(theLewis lung cancer cell lines,LLC)CXCR4~+与CXCR4~-亚群间的差异表达.方法 免疫磁珠分选CXCR4~+和CXCR4~-LLC细胞,Trizol法抽提细胞总RNA,实时荧光定量PCR(TaqMan探针)检测miRNAs表达,对表达差异最为显著的miRNAs进行潜在靶基因预测,应用免疫组化方法 初步分析具有研究价值的关键分子在两个不同亚群小鼠种植瘤组织中的表达情况,并通过BLAST对其3'非翻译端(untranslated region,UTR)进行直向同源基因序列比对分析.结果 CXCR4~+与CXCR4~-LLC比较,各检测mirna表达均较低,其中以miR-223差异最为显著(Fold Change=8.26),通过软件分析预测,miR-223与IGFIR、IGFBP5、Pik3cb、ELK-1和E2F1等基因均具有可能靶位点,免疫组化检测发现CXCR4~+亚群种植瘤组织IGFIR表达显著高于CXCR4~-亚群,IGF1R 3'UTR的238～244 nt和688～695 nt两个结合位点具有高度的进化保守性.结论 miR-223在CXCR4~+LLC中显著低表达,可能与肺腺癌细胞IGFIR信号通路调控有关.     

CXCR4阳性Lewis肺癌细胞具有促发新生血管形成的特征

目的 研究CXCR4阳性Lewis肺癌细胞(LLC)在新生血管形成时的始动作用.方法 激光共聚焦检测LLC细胞系中CXCR4抗原表达情况,观察小鼠移植瘤组织内CXCR4阳性LLC与新生血管的毗邻关系;以CXCR4作为磁珠分选细胞的表面标志,检测CXCR4阳性和阴性LLC中VEGF、MMP9 mRNA表达情况,同时免疫组化检测两亚群细胞移植瘤中VEGF、MMP9以及CD31表达情况.结果 CXCR4阳性LLC多毗邻内皮细胞,周围形成血管样结构;CXCR4阳性LLC的VEGF mRNA表达(0.439 8±0.059)明显高于CXCR4阴性LLC (0.289 9±0.003 1)(P＜0.01);CXCR4阳性LLC的MMP9 mRNA表达(0.622 3±0.013 6)明显高于CXCR4阴性LLC(0.579 2±0.017 4)(P＜0.05);CXCR4阳性LLC移植瘤组织MVD(56.87±4.83)明显高于CXCR4阴性LLC移植瘤(43.52±4.91)(P＜0.01). 结论 LLC中的CXCR4阳性亚群具有更强上调VEGF、MMP9表达的能力,具有促发新生血管形成的特征.     

HGF抗肾脏纤维化机制的研究进展

转化生长因子β1(TGF-β1)是一种重要的促纤维化因子,它主要通过激活Smad通路促进肾脏纤维化的发生和发展。而肝细胞生长因子(HGF)被认为是一种抗纤维化因子,它的抗纤维化作用与消除TGF-β1的作用密不可分,它能以不同的方式阻断TGF-β1的信号转导。在系膜细胞中,HGF通过稳定TGIF(TGinteractingfactor,TGIF)蛋白以中断TGF-β1信号的转导;在间质成纤维细胞中,HGF阻止Smad复合物核转移而中断TGF-β1信号转导;在肾小管上皮细胞中,HGF增加另一种转录共抑制因子SnoN的表达。     

有丝分裂阻滞缺陷蛋白2在子宫内膜癌组织中的表达及临床意义

目的研究有丝分裂阻滞缺陷蛋白2(MAD2)在子宫内膜癌组织的表达及其临床意义。方法应用免疫组织化学方法检测60例子宫内膜癌和15例良性增生期子宫内膜组织中MAD2蛋白表达情况,分析其表达与临床特征的关系。结果 MAD2在子宫内膜癌组织中表达强度高于良性增生子宫内膜组织。根据染色强度将子宫内膜癌患者分为高表达组及低表达组,MAD2高表达与淋巴转移、手术病理分期有关,而与患者年龄、病理类型、组织学分化程度及激素受体表达无关。MAD2高表达组患者生存期明显短于低表达组。结论子宫内膜癌组织MAD2表达强度与其肿瘤的生物学行为及预后密切相关。