腺病毒提高腺相关病毒在耐药与非耐药肿瘤细胞中的基因表达及其机制

目的:研究利用低剂量腺病毒提高重组腺相关病毒2型(recombined adeno-associated virus,rAAV2)在耐药与非耐药肿瘤细胞中基因表达水平的新方法,并初步探讨其可能的作用机制。方法:rAAV2-GFP单独或联合复制缺陷型腺病毒(Ad5-RFP)或条件复制型腺病毒(Ad5-TERT-RFP)感染人非小细胞肺癌细胞系(NCI-H446)、人肺腺癌细胞系(A549)、人胃癌细胞系(SGC7901)、人口腔黏膜上皮癌细胞系(KB)和人口腔黏膜上皮癌耐长春新碱细胞系(KB/VCR)。荧光显微镜观察和流式细胞仪分析肿瘤细胞感染后GFP的表达;Western blotting检测感染后肿瘤细胞GFP蛋白表达及ERK和AKT磷酸化水平;Real-time PCR检测肿瘤细胞内GFP的mRNA表达量、DNA拷贝数,以及细胞表面受体HSPG、α_v integrin和FGFR-1的mRNA表达。结果:流式细胞结果显示,rAAV2-GFP联合Ad5-RFP或Ad-TERT-RFP感染肿瘤细胞24h后,GFP阳性细胞率和GFP平均荧光亮度分别提高了约0.3～3倍和4～8倍。Western blotting证实联合应用Ad5-RFP感染肿瘤细胞后24h,GFP蛋白表达增加约4～6倍,肿瘤细胞内ERK和AKT磷酸化水平升高。联合感染后细胞内GFP的mRNA表达量提高了3.83～7.33倍,DNA拷贝数未见明显改变,HSPG、α_v integrin和FGFR-1的mRNA表达轻微提高。结论:低剂量腺病毒显著提高rAAV2在耐药与非耐药肿瘤细胞中的基因表达水平,可能与激活信号传导通路、增加细胞内转录有关。     

胰岛素及高糖对牛视网膜血管内皮细胞线粒体活性氧产生和凋亡的影响

胰岛素有促使血管细胞对葡萄糖转移和利用~([1,2]),促进蛋白质合成及血管细胞增生~([3])等作用.有研究报道,胰岛素能在HepG2、3T3L1脂、甲状腺及人成纤维细胞等多种细胞中增加线粒体活性氧产生~([4-7]).正常浓度活性氧(ROS)能发挥信号分子功能,促进细胞分泌因子及细胞增生.高浓度ROS可通过氧化修饰蛋白、脂质过氧化,诱导DNA链断裂引起细胞损伤和死亡~([8]).     

二氯化钴对腺病毒基因表达的影响

目的:研究二氯化钴(CoCl2)对缺氧反应元件调控E1AE1B表达的条件复制型腺病毒载体(Ad-5HRE-E1AE1B-RFP)和缺乏缺氧反应元件的复制缺陷型腺病毒载体(Ad-EGFP)在肿瘤细胞内表达和复制的影响. 方法:肿瘤细胞经不同浓度的CoCl2 处理后,Western 印迹法检测缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)的表达;倒置荧光显微镜、FCM法及空斑形成实验等观察经CoCl2处理后,感染条件复制型腺病毒和(或)复制缺陷型腺病毒的肿瘤细胞中外源基因的表达水平和病毒复制情况;小动物成像仪观察缺氧调控的条件复制型腺病毒在肿瘤内提高复制缺陷型腺病毒表达的效率. 结果:适当浓度的CoCl2 (0.4和0.08 μg/mL) 能使胃癌细胞株(SGC7901)中HIF-1α蛋白稳定表达并积聚,可较好地模拟缺氧状态;在0.4 μg/mL CoCl2作用下,Ad-5HRE-E1AE1B-RFP对肿瘤细胞的感染效率明显提高,表现为外源基因RFP阳性表达的百分率和荧光强度均明显提高,但空斑形成实验显示Ad-5HRE-E1AE1B-RFP并没有复制.0.4 μg/mL CoCl2也能提高其他非缺氧调控的复制缺陷型腺病毒如Ad-EGFP、Ad-Luc的感染效率和表达水平; Ad-5HRE-E1AE1B-RFP与复制缺陷型腺病毒Ad-Luc联合注射裸鼠肿瘤能显著提高Ad-Luc的表达.结论:CoCl2 能明显提高腺病毒的基因表达水平,其作用机制不仅与CoCl2诱导缺氧有关,也可能与影响基因转录有关.     

依托泊苷提高复制缺陷型腺病毒介导外源基因在肿瘤细胞中的表达水平

肿瘤免疫逃逸是指肿瘤细胞通过某种机制逃避机体免疫系统对其的监视与杀伤,从而导致肿瘤的发生、发展、转移和复发的现象。迄今已发现多种机制参与肿瘤的免疫逃逸,可概括为两个方面:一是来自肿瘤细胞及肿瘤抗原本身的改变,如肿瘤细胞MHC或共刺激分子缺如、肿瘤抗原的免疫原性减     

我国西南地区少数民族大学生人格特征的研究

目的 了解少数民族大学生的个性差异，为开展心理健康教育提供依据。方法 采用卡特尔16种人格因素对少数民族大学生进行问卷调查，并进行统计处理。结果 少数民族大学生分别与常模、师范学生比较，其个性特征均存在差异性。     

在体电穿孔辅助基因转染视网膜色素上皮细胞层和光感受器细胞层的实验研究

目的　探讨在体电穿孔辅助基因转染视网膜色素上皮（RPE）细胞层和光感受器（PR）细胞层的可行性。方法　147只健康雄性Spragne-Dawley(SD)大鼠根据电穿孔刺激模式电压值分为5、10、15、20、25、30、35 V组,右眼视网膜下腔注射增强型绿色荧光蛋白（EGFP）真核表达质粒pEGFP N1为实验眼,左眼注射TE Buffer 为对照眼。各组根据不同转染方向再分为RPE和PR两个亚组。各组除电压不同外,其余参数均为脉宽99 ms,脉冲间期0.5 s,连续5个脉冲。将带有负电荷的质粒在电场作用下,拟转染到RPE细胞层,反向置电极,拟转染到PR细胞层。转染后7 d 取各组视网膜铺片,荧光显微镜下观察EGFP表达强弱、范围及荧光细胞计数分析;采用蛋白质免疫印迹法（Western blot）、实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）半定量观察EGFP蛋白和mRNA的表达。结果　转染后7 d,荧光显微镜观察发现,各组RPE亚组对照眼RPE细胞层内均未见特异性荧光表达,实验眼可见绿色荧光表达;各组RPE亚组对照眼视网膜铺片均未见荧光表达,实验眼视网膜铺片均可见转染了EGFP的RPE细胞。Western blot检测显示,随电压增加,EGFP蛋白与β-肌动蛋白条带灰度相对比值呈上升趋势。RT-PCR检测显示,各组均产生阳性扩增条带,随电压增高,EGFP mRNA与GADPH mRNA扩增条带灰度相对比值逐渐增高。结论　在体电穿孔方法可以有效辅助基因转染大鼠RPE细胞层。      

变性高效液相色谱检测视网膜母细胞瘤Rb1基因外显子

目的探讨变性高效液相色谱（denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC）检测视网膜母细胞瘤（retinoblastoma,RB）Rb1基因外显子突变的情况。方法收集25例RB患者的肿瘤组织和3例健康者的外周血。提取其基因组,扩增Rb1基因的第3、7、9、12和26个外显子片段,再以DHPLC和DNA直接测序法分别检测其突变情况并进行比较。结果所有模板均扩增出5个外显子片段。DHPLC分析得第3、7、9、12和26个外显子的最优化检测柱温分别为54．4、55．2、53．4、53．4和55．2℃;第3、7、9和12个外显子中,25例患者和3例健康者均呈现同样峰形;而第26个外显子中,有2例患者呈现不同峰形。对所有片段进行测序,第3、7、9和12外显子的扩增片段中未发现突变。而外显子26的扩增片段中,DHPLC峰形和其他片段不同的2个样品也未出现突变。DHPLC和直接测序结果的差异无统计学意义（P〉0．05）。结论DHPLC能快速检测出Rb1基因外显子片段的突变位点,可以用于RB的检测。     

川芎嗪促进大鼠视网膜神经节细胞轴突再生的实验研究

目的通过在视网膜组织三维立体培养系统中加入不同浓度的川芎嗪溶液,观察川芎嗪对视网膜神经节细胞轴突再生的作用。方法建立体外培养的大鼠视网膜组织三维立体培养系统,将1～3d新生远交群SD（Sprague Dawley）大鼠视网膜切成0．5mm×0．5mm大小的视网膜组织,加入不同浓度（0．125、0．25、0．5、1．0g／L）川芎嗪溶液后,在相差显微镜下动态观察视网膜神经节细胞轴突的生长情况,于加药后第3、6和9天记录再生轴突的数目及长度。结果与对照组相比,各浓度川芎嗪对视网膜神经节细胞轴突生长均有促进作用,以0．5g／L浓度效果最明显,差异有统计学意义（P〈0．05）。免疫组织化学染色显示视网膜神经节细胞的轴突具有明显再生现象。结论一定剂量范围的川芎嗪可促进视网膜神经节细胞轴突再生和伸长。（中国跟耳鼻喉科杂志,2009,9：86—88）     

不同重组病毒载体在大鼠骨髓间充质干细胞中的转染效率及基因表达

目的：探讨不同的重组病毒载体对体外培养的SD大鼠骨髓间充质干细胞（rMSCs）的转染效率和外源基因表达水平,为利用骨髓间充质干细胞进行细胞和基因治疗提供实验依据。方法：采用淋巴细胞分离液、密度梯度离心及体外培养方法分离rMSCs,流式细胞仪检测细胞表面CD11b、CD45和CD90的表达鉴定细胞类型。进一步用携带绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因的重组Ad5-EGFP、Ad5F35-EGFP、rAAV1/2-EGFP、rAAV2-EGFP及Lentivirus-EGFP转染体外培养的rMSCs,荧光显微镜观察、流式细胞仪检测EGFP阳性率和荧光强度。结果：rMSCs细胞表面CD11b、CD45和CD90阳性率分别为（14.1±3.3）%、（1.1±0.4）%和（82.3±5.7）%。Ad5-EGFP按10、100和1000MOI转染rMSCs,2d后流式细胞仪检测,EGFP阳性率分别为（33.6±2.7）%、（88.6±1.0）%及（99.9±0.1）%,荧光强度为4.4±0.3、39.8±1.5及811.4±3.9;Ad5F35-EGFP按10、100和1000MOI转染rMSCs,2d后阳性率分别为（96.9±0.4）%、（99.9±0.1）%及（99.7±0.1）%,荧光平均强度为369.3±14.8、895.4±7.5及703.2±38.4;rAAV1/2-EGFP及rAAV2-EGFP按1×104和1×105vg/细胞转染rMSCs,6d后阳性率分别为（0.94±0.31）%及（1.30±0.36）%,和（2.16±0.38）%及（3.90±0.33）%;LV-EGFP按30（TU/细胞）转染rMSCs,6d后阳性率为（60.5±3.2）%,荧光强度为27.0±3.6。结论：Ad5、Ad5F35及LV能够有效转染体外培养的rMSCs并表达外源基因,转染效率与病毒的用量间存在量效关系。