抗肿瘤的PF4及相关肽基因重组腺病毒的构建

利用细菌内同源重组法构建含PF4(血小板第四因子)全长1-70及PF4的小肽17-70基因的重组腺病毒。方法:将连有MCP-1信号肽的PF4全长及其C末端的改构体PF4-17-70两个基因片段克隆至腺病毒穿梭质粒pAdshuttle-CMV中,形成转移质粒pAdshuttle/PF4(1-70)和pAdshuttle/PF4(17-70),将之酶切线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183,抽提并鉴定含目的基因的重组体质粒,而后用磷酸钙共沉淀方法转染HEK293细胞,包装成重组腺病毒AdPF4(1-70)和AdPF4(17-70)。采用PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定,扩增并纯化病毒,用TCID50方法测病毒滴度,利用带有CMV-LacZ的对照重组腺病毒(Ad-LacZ)对感染效率进行监测。结果:利用电穿孔法分别将质粒pAdshuttle/PF4(1-70),pAdshuttle/PF4(17-70)与质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183获得70%以上的阳性重组体细菌克隆。PCR检测结果表明重组腺病毒已含有目的基因,滴度为1×1010pfu/ml。结论:利用细菌内同源重组法可以简便、快捷地构建含PF4(1-70)、PF4(17-70)cDNA的腺病毒载体,为两者在肿瘤基因治疗中的应用奠定了基础。     

癌蛋白iASPP对小鼠骨髓细胞增生促进作用研究

 目的　研究iASPP（一个新发现的p53家族抑制性成员）在小鼠骨髓细胞中过表达对细胞增生作用的影响。方法　构建反转录病毒载体,通过基因转导方法,使小鼠骨髓细胞过表达人类iASPP或（和）突变的N-Ras,采用集落形成实验检测细胞体外增生能力的变化。结果　转导iASPP的小鼠骨髓细胞与转导空载体对照组相比集落形成能力显著增强（P＜0.01）,转导突变的N-Ras也能提高小鼠骨髓细胞的体外增生能力,二者差异无统计学意义（P＞0.05）,但iASPP联合突变的N-Ras可使集落的数量显著多于单基因组（P＜0.05）及空载体对照组（P＜0.01）,而且集落体积增大。结论　癌蛋白iASPP可以显著提高小鼠骨髓细胞的体外增生能力,并且与突变的N-Ras具有协同作用,因而iASPP有望成为研究肿瘤及白血病治疗的新靶点。     

同源结构域相互作用蛋白激酶2的研究进展

同源结构域相互作用蛋白激酶2(HIPK2)是一个核内丝氨酸／苏氨酸激酶,作为辅助因子,广泛参与转录调控。HIPK2位于核斑,在Sp100和TP53INPls的辅助下能够磷酸化p53的46位丝氨酸,加速p53的乙酰化,拮抗MDM2对p53的抑制作用,强化p53的功能。通过磷酸化,HIPK2加速CtBP和c- Myb被蛋白酶体降解,引起细胞发生不依赖p53的凋亡或分化。许多肿瘤细胞低表达HIPK2,表明HIPK2 可能是一个重要的抑癌基因。     

抗CD44抗体单链抗体构建及表达

目的构建抗 CD44抗体的单链抗体(anti-CD44-ScFv),为进一步应用基因工程抗体研究打下基础。方法从分泌抗 CD44单克隆抗体的杂交瘤细胞系 HII44a 中提取总 RNA,经 RT-PCR 分离获得了轻、重链可变区(V_L、V_H)基因,用连接肽将其构建成具有 V_L-Linker-V_H 结构的单链抗体基因,并将构建的单链抗体基因克隆到分泌型蛋白表达载体 PET22b( )中进行表达。结果经测序表明,V_H、V_L 及 Linker 的序列正确。ScFv 在大肠杆菌中的表达量约占菌体总蛋白的16%。能够特异性与 CD44抗原结合。结论成功构建抗 CD44抗体单链抗体,为进一步制备基因工程抗体奠定了基础。     

抗CD44抗体HI44a对白血病细胞分化与凋亡作用的体外研究

背景与目的探讨抗CD44抗体HI44a对新鲜白血病细胞分化及凋亡的作用。材料与方法从细胞形态学、四氮唑蓝(NBT)还原反应和细胞分化特异性抗原CD11b,CD14和CD15的变化,体外研究HI44a对31例急性髓系白血病患者白血病细胞的诱导分化作用。并利用Annexin-Ⅴ试剂盒检测HI44a对白血病细胞的凋亡诱导,RT-PCR方法检测其对细胞分化相关因子G-CSF,M-CSF及原癌基因c-myc表达的影响。结果经HI44a作用后,白血病细胞形态向成熟方向转变;M2~M5各亚型的NBT还原反应阳性率分别升高到31%(对照为9%)、55%(对照为10%)、25%(对照为12%)和32%(对照为11%),与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.01)。CD11b,CD14和CD15表达分别由对照组的9.65%、27.40%、57.38%升高到19.29%、40.60%和66.82%(P均<0.01)。细胞的早期凋亡率由对照组的26.21%升高到41.18%。RT-PCR检测发现HI44a作用后,M-CSF表达增强,而原癌基因c-myc表达降低。结论HI44a能够有效的诱导白血病细胞分化及凋亡,为治疗急性髓性白血病提供了一条新思路。     

抗人iASPP单克隆抗体的制备及研究应用

脾脏内注射iASPP-SV真核表达质粒免疫Ba1b／c小鼠3d后，取小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤细胞（NSl）进行常规融合。应用原核表达的iASPP-SV全长及iASPP-SV片段His-tag融合蛋白进行间接酶联免疫吸附方法筛选阳性克隆，并对亚克隆后的阳性杂交瘤细胞株所制备的腹水进行了初步生物学特性鉴定。结果获得了6株可稳定分泌特异性抗人癌蛋白iASPP单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并可以应用于Western Blot、免疫组织化学等实验。因此，本研究成功制备了抗人癌蛋白iASPP的单克隆抗体。     

腺病毒介导的PF4cDNA对HUVEC的抑制作用

目的 :用一种简便方法构建了含血小板第四因子 (PF4)cDNA的腺病毒载体 ,体外检测其抑制人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)活性。方法 :将含有信号肽的PF4cDNA克隆至腺病毒穿梭质粒 pAdshuttle CMV中 ,形成转移质粒pAdshuttle/PF4,将之用PmeI酶切线性化后与腺病毒骨架质粒 pAdEasy 1共转化大肠杆菌BJ5 183 ,抽提并鉴定含目的基因的重组体质粒 ,PacI酶切后用磷酸钙共沉淀方法转染HEK2 93细胞 ,包装成重组腺病毒AdPF4。经鉴定后扩增、纯化、测病毒滴度及感染率。直接转导HUVEC检测表达蛋白活性。结果 :经鉴定此病毒DNA有PF4cDNA插入 ,病毒滴度可达 1× 10 1 0 pfu/ml,转导AdPF4病毒后的人脐静脉内皮细胞较对照含空载体病毒增殖减低 5 3 %。结论 :实验证实腺病毒介导的PF4cDNA体外具有抑制内皮细胞增殖活性。     

同源结构域相互作用蛋白激酶2的研究进展

同源结构域相互作用蛋白激酶2(HIPK2)是一个核内丝氨酸／苏氨酸激酶，作为辅助因子，广泛参与转录调控。HIPK2位于核斑，在Sp100和TP53INP1s的辅助下能够磷酸化p53的46位丝氨酸，加速p53的乙酰化，拮抗MI)M2对p53的抑制作用，强化p53的功能。通过磷酸化，HPK2加速CtBP和c-Myb被蛋白酶体降解，引起细胞发生不依赖p53的凋亡或分化。许多肿瘤细胞低表达HIPK2，表明HIPK2可能是一个重要的抑癌基因。     

PUMA的研究进展

PUMA是新近发现的p53的靶基因,属于bcl-2家族的BH-3亚家族成员,其蛋白产物定位于细胞的线粒体上,参与p53依赖和非依赖途径的促凋亡过程。由于在放化疗、许多病理性凋亡和肿瘤发生过程中发挥着重要作用,提示PUMA有可能成为人类肿瘤和其他疾病治疗的新靶点。     

抗CD44抗体单链抗体构建及表达

目的 构建抗CD44抗体的单链抗体（anti-CD44-ScFv），为进一步应用基因工程抗体研究打下基础。方法 从分泌抗CD44单克隆抗体的杂交瘤细胞系HII44a中提取总RNA，经RT-PCR分离获得了轻、重链可变区（VL、VH）基因，用连接肽将其构建成具有VL-Linker-VH结构的单链抗体基因，并将构建的单链抗体基因克隆到分泌型蛋白表达载体PEV22b（＋）中进行表达。结果 经测序表明，VH、VL及Linker的序列正确。ScFv在大肠杆菌中的表达量约占菌体总蛋白的16％。能够特异性与CD44抗原结合。结论 成功构建抗CD44抗体单链抗体，为进一步制备基因工程抗体奠定了基础。