减毒猪霍乱沙门菌ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)宿主-载体平衡致死系统的构建及其生物学特性研究

目的:开发应用于猪的稳定携带异源基因的口服活疫苗载体。方法:本研究在减毒猪霍乱沙门菌ΔcrpΔcya C78-1的基础上,运用自杀性质粒pREasd介导的细菌同源重组技术,构建缺失株ΔcrpΔcyaΔasd C78-1,再将携带asd基因的互补质粒p YA3493电转至上述菌株,构建ΔcrpΔcyaΔasd C78-1(p YA3493)宿主-载体平衡致死系统,并进一步研究其生物学特性。结果:PCR及测序结果共同表明ΔcrpΔcyaΔasd C78-1(p YA3493)构建成功。生物学特性检测结果表明ΔcrpΔcyaΔasd C78-1(p YA3493)的血清型与亲本株ΔcrpΔcya C78-1和疫苗株C500相同,并能够稳定遗传缺失型asd基因片段;其生长速度略慢于ΔcrpΔcya C78-1,且二者均明显慢于疫苗株C500;其生化特性结果也与ΔcrpΔcya C78-1基本相同。小鼠口服攻毒试验表明ΔcrpΔcyaΔasd C78-1(p YA3493)的毒力与ΔcrpΔcya C78-1基本相当,但其半数致死量约为疫苗株C500的412倍。结论:上述结果表明,减毒猪霍乱沙门菌ΔcrpΔcyaΔasd C78-1(p YA3493)有潜力作为高效表达外源基因的口服活疫苗载体。     

人组织型纤溶酶原激活剂cDNA在鸡体内表达及其生物学活性检测

 目的探讨人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)基因cDNA在鸡体内表达和在卵黄中的积淀规律,检测卵黄中t-PA的含量和生物学活性。方法将含人t-PA基因cDNA的真核表达质粒pcDNA₃-t-PA注射于鸡的骨骼肌,收集不同时间的鸡蛋,West-ern blotting检测卵黄中t-PA表达状况,ELISA检测卵黄中t-PA的含量,琼脂糖平板溶圈法检测活性。结果注射表达质粒后1周,卵黄中即有t-PA积淀,第2～3周达到表达高峰,表达量可达6.1mg·L^-1;所表达的t-PA具有激活组织纤溶酶的活性,注射后第2～3周,每1mL卵黄中t-PA的活性相当于37-45.8μg标准t-PA。结论t-PA基因能够在鸡骨骼肌细胞中表达并在卵黄中积淀,这一途径有望成为药物蛋白基因在鸡体内大量表达生产的优选方式。     

胎盘人整合素αvβ3蛋白的纯化及其鉴定

目的 从人胎盘组织中纯化整合素αvβ3蛋白，研究其免疫原性。方法 采用溴化氰活化的Sepharose-4B为基质，通过交联经蛋白G柱纯化的单克隆抗体，用亲和层析的技术纯化整合素αvβ3蛋白。SDS-PAGE鉴定纯化的蛋白。并用ELISA检测整合素αvβ3蛋白的免疫反应性。结果 利用单抗-Sephamse-4B亲和层析柱，从人胎盘组织中纯化得到了整合素αvβ3，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳证实纯化蛋白的为α和β两个亚基所组成，分子量约为125KD和110KD，ELISA结果显示整合素αvβ3具有良好的抗原结合活性。从胎盘组织中纯化整合素αvβ3抗原的收获率约为700μg／胎盘。结论 从人胎盘组织中成功获取整合素αvβ3抗原，为后续研究奠定了基础。     

生物技术减毒沙门氏菌介导apo-t-PA-GFP融合基因在鸡体内表达和在卵黄中沉积的研究

 目的 探讨以减毒沙门氏菌为载体携带目的基因在家禽体内表达,并实现表达产物在卵黄中定向沉积的可行性。方法 将人t-PA基因与鸡VLDLy组装前体apo基因融合,构建pApo-tPA-GFP表达质粒,电转化至减毒鼠伤寒沙门氏菌△crp SL1344中,阳性重组菌静脉注射高产蛋鸡,收集不同时期鸡蛋,涂片荧光镜检和ELISA检测表达产物在卵黄中沉积情况和表达水平,平板溶圈法检测卵黄中表达产物的活性。结果 注射表达质粒第8天开始卵黄中有荧光颗粒出现,第21天表达量最高,为10.4 μg·mL-1,活性相当于50.2 μg·mL-1标准品t-PA。结论 研究表明,减毒沙门氏菌能够介导apo-t-PA-GFP融合基因在鸡体内表达,且apo载脂蛋白能够引导t-PA透过卵黄膜实现在卵黄中沉积,这一途径简捷、方便,为外源基因在动物体内的表达研究提供了理论和技术基础。     

旋毛虫5'-nucleotidase基因特征与克隆表达

目的 研究旋毛虫5'-nucleotidase基因的序列结构特征及其蛋白克隆表达。方法 从旋毛虫获得5'-nucleotidase基因的序列,利用生物信息学方法进行系统性分析,并进行原核表达。结果 旋毛虫5'-nucleotidase基因大小为1 653 bp,编码550个氨基酸,119个氨基酸残基组成,理论相对分子质量(Mr)为62 kD,分子式为C₂₈₀₀H₄₃₅₈N₇₄₂O₈₀₃S₂₃,等电点为6.13,属于稳定存在的亲水蛋白质。该蛋白含有21个氨基酸组成的信号肽,同时具有跨膜区域,此外还含有3个N-糖基化位点、2个O-糖基化位点、20个磷酸化位点、28个B细胞线性结合位点和13个T细胞结合位点。二级结构中,α-螺旋占43.27%(238个),伸展链占22.73%(125个),β-折叠占7.82%(43个),无规则卷曲占26.18%(144个)。SDS-PAGE显示,5'-nucleotidase基因在原核表达系统中呈可溶性形式表达,重组蛋白大小约为74 kD。结论 成功克隆了旋毛虫5'-nucleotidase基因,对其进行序列分析和原核表达,为进一步探究5'-nucleotidase蛋白在旋毛虫感染过程中的作用奠定基础。     

鸡IL-18在毕赤酵母中的表达与活性分析

目的:在毕赤酵母中表达鸡白介素18,并鉴定其活性.方法:应用PCR技术从重组质粒pMD18-T-ChIL-18中扩增出鸡IL-18成熟肽基因,亚克隆于毕赤酵母表达载体pPICZαA上,构建重组质粒pPICZαA-ChIL-18.经酶切、PCR和测序鉴定正确后,电转化入毕赤酵母菌X-33,筛选多拷贝单克隆进行诱导表达.表达产物纯化后用Western blot、ELISA和淋巴细胞转化试验分析其生物学活性.结果:重组菌正确表达了具有免疫原性的鸡IL-18,经分析该rchIL-18具有诱导淋巴细胞分泌γ干扰素和刺激淋巴细胞增殖的活性.结论:成功的在毕赤酵母中表达了具有生物活性的鸡IL-18.     

NDV F基因DNA疫苗对新城疫病毒灭活油乳苗的免疫协同作用

目的：为进一步探讨控制新城疫发生和流行的新途径。方法：利用所构建的F基因pcDNA3真核表达质粒（DNA疫苗）和新研制的地方流行株灭活油乳苗，观察了新城疫病毒F基因DNA疫苗对地方分离株灭活油乳苗的免疫协同作用。结果：在7日龄时应用灭活油乳苗和DNA疫苗联合免疫的鸡群，在14～57日龄整个观察期内，不但其胸腺T淋巴细胞对ConA、法氏囊B淋巴细胞对PMA的反应均明显强于单纯油乳苗免疫组（其中除在接种后第7天时两组鸡的B淋巴细胞增殖OD570值差异不显著外，其余各检测时间两组间均表现为差异显著（P〈0．05）或极显著（P〈0．01），特别是T淋巴细胞增殖情况在接种第14天后均表现为差异极显著（P〈0．01））；而且HI抗体效价水平也持续性高于单纯油乳苗免疫鸡群，并在免疫接种后35～49天时差异显著（P〈0．05）。在免疫接种后第49天时进行的攻毒保护试验中，联合免疫组的保护率为100％，而单纯油乳苗免疫组鸡在观察期内则有2只发病，保护率为86．7％，且有1只死亡。结论：试验所用F基因DNA疫苗和灭活油乳苗联合免疫可显著提高机体的体液免疫和细胞免疫水平，产生较好的免疫协同作用，从而使机体对NDV的综合免疫保护能力得到进一步的提高。     

鸡IL-18真核表达载体的构建及其对IBD灭活疫苗免疫增强作用的研究

目的 :探讨鸡IL 18的功能活性及对鸡用疫苗的免疫增强作用。方法 :将鸡IL 18编码区cDNA定向克隆至pcDNA3载体构建了鸡IL 18真核表达质粒 ,与传染性法氏囊病 (IBD)灭活疫苗联合应用 ,通过中和抗体的检测、胸腺T淋巴细胞对ConA、法氏囊B淋巴细胞对PMA增殖反应的观察 ,研究了其对IBD胚毒灭活疫苗的免疫增强效果。结果 :同时接种IBD灭活疫苗和IL 18真核表达质粒的免疫鸡所产生的中和抗体效价在接种第 2 8天后明显高于单纯疫苗组 (P <0 0 5 ) ;其T、B淋巴细胞的增殖反应也强于单纯疫苗组 ,尤其是T淋巴细胞的增殖反应从接种后第 2 1天开始即明显强于单纯疫苗组 (P <0 0 5 ) ;接种后第 4 2天时进行的攻毒试验结果表明 ,同时接种IL 18表达质粒的试验组鸡获得 93 3%的保护 ,而单纯疫苗接种组的保护率只有 86 7%。结论 :鸡IL 18真核表达质粒在鸡体内得到了良好表达 ,表达产物不但具有明显的增强IBD灭活疫苗诱导细胞免疫的作用 ;同时 ,对于中和抗体水平的提高、B淋巴细胞增殖反应的加强也具有明显的作用。科技大学禽病研究室应用IBDV地方野毒株 (L0 15和L0 17株 )所制备的胚毒灭活油乳苗。1 1 2　实验用鸡　为洛阳市新安县机械化鸡场提供的 1日龄健康罗曼雏公鸡 ,自饲养至所需日龄。1 1 3　种毒与抗原　攻毒用IB     

鼠伤寒沙门菌SL1344株侵袭性蛋白B缺失株的构建及生物学特性

目的:为了研制更加安全的鼠伤寒沙门菌弱毒株,本研究构建了鼠伤寒沙门菌SL1344Δsip B基因缺失突变株。方法:首先构建含缺失585 bp sipB基因的重组自杀性质粒PREΔsipB,利用重组自杀性质粒介导的等位基因交换技术,两步法筛选出SL1344的sip B缺失株。结果:PCR及测序结果表明SL1344ΔsipB构建成功。进一步生物学特性研究表明,缺失株SL1344ΔsipB保留了亲本菌株SL1344的血清型1,4,5,12:i:1,2,且能够稳定遗传缺失585 bp的sipB基因,生长速度没有发生明显改变;但是,与亲本株SL1344相比,其毒力发生明显改变,缺失株SL1344ΔsipB口服感染6周龄BALB/c小鼠的LD50为1.70×108CFU,毒力较亲本株SL1344降低至1.4%,免疫保护效力实验显示,对6周龄BALB/c小鼠免疫后第17天,鼠伤寒沙门菌野生株攻毒有50%的保护率。在给小鼠免疫后第14天血清抗体IgG达到最高。结论:结果表明,SL1344ΔsipB基因缺失株构建成功,遗传稳定,毒力明显降低,且具有较好的免疫原性,为研究鼠伤寒沙门菌sipB基因与其致病力之间的关系提供了方法,并为研制安全有效的沙门菌疫苗弱毒株奠定了基础。