基于巴戟天转录组数据的R2R3-MYB转录因子的鉴定和分析

为了挖掘参与巴戟天生长发育及次生代谢产物合成的MYB转录因子,本研究基于巴戟天根茎叶的转录组数据,筛选并鉴定巴戟天的R2R3-MYB转录因子,为以后通过遗传改良的手段调控巴戟天的代谢机制提供理论基础。根据巴戟天根茎叶的转录组数据,利用PFAM和plantTFDB等5个数据库,对预测的巴戟天R2R3-MYB转录因子进行鉴定, GO功能注释和分类、保守结构域分析、进化树比对分析和组织特异性表达差异分析。基于巴戟天的转录组数据共鉴定109个MYB转录因子,其中R2R3-MYB的数量为51个。亚细胞定位结果显示多数序列定位于细胞核,少部分位于细胞外基质。与分子功能、生物过程和细胞组分相关的GO terms的数量分别为112、76和239个。51个巴戟天R2R3-MYB转录因子中的R2-MYB和R3-MYB的保守基序分别为:-W-(X19)-W-(X19)-W-,-F-(X18)-W-(X18)-W-。通过与拟南芥R2R3-MYB转录因子的序列比对分析可知,除了S10、S19和S21亚家族没有分布,其他亚家族中都存在同源序列。RT-qPCR的结果验证了部分R2R3-MYB基因在3个组织差异性表达。获得的51个R2R3-MYB转录因子为进一步研究巴戟天MYB转录因子家族提供了一定的理论基础。     

巴戟天实时荧光定量PCR内参基因的选择

目的选择合适的内参基因,用于巴戟天不同组织和不同处理的叶中目标基因表达量的分析检测。方法以巴戟天不同组织和不同处理的叶为材料,根据巴戟天转录组数据,选择甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、细胞色素P450(cytochrome P450,CYP)、微管蛋白α(tubulinalpha,TUA)和肌动蛋白(Actin)基因等10个内参基因作为候选基因。利用实时荧光定量技术,并结合geNorm、NormFinder和BestKeeper等软件分析内参基因的表达稳定性,从而筛选出巴戟天不同组织和不同处理叶中表达稳定的内参基因。选择合适的内参基因对巴戟天的1-脱氧木酮糖-5磷酸合成酶(DXS)和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)基因在不同组织和不同处理的叶中相对表达量进行分析。结果内参基因GAPDH和泛素(UBQ)在巴戟天不同组织中表达最稳定,GAPDH+UBQ的双内参组合能够更加准确地分析目的基因在巴戟天不同组织的相对表达量,而在不同处理的叶中GAPDH和Actin表达稳定性最好,选择GAPDH+Actin的双内参组合可以确保目的基因相对分析表达结果的可靠性。在巴戟天不同组织中,DXS目的基因的相对表达量为根<茎<叶,DXR的相对表达量为茎<根<叶。在巴戟天不同处理的叶中,DXS和DXR基因的相对表达量相对于未处理的叶(CK)都有所提高。结论筛选得到的稳定内参基因为后续巴戟天相关基因表达研究奠定基础,使用2个稳定内参的组合对目的基因进行均一化处理有利于提高目的基因表达分析的准确性。