皮肤角质形成细胞的无血清培养方法

目的探索建立少量成年自体皮肤角质形成细胞体外无血清培养体系,为自体组织工程皮肤的构建与移植奠定物质基础。方法:无菌条件下,取2cm×2cm 兔耳皮肤组织块,Dispase 消化,分离真表皮,表皮以胰蛋白酶+EDTA 消化获得角质形成细胞,以含钙和不含钙的角质形成细胞培养液(K-SFM),按不同细胞密度接种于24孔板,观察细胞生长状况;免疫组化鉴定,MTT 法测定不同血清浓度对角质形成细胞增殖分化的影响。结果:在适当的 Ca~(2+)浓度下,少量自体角质形成细胞能够在无血清培养液 k-SFM 中培养扩增,最多可传4～6代。添加血清后可明显加速细胞分化。结论:无血清培养体系适用于少量成年自体角质形成细胞的体外连续培养扩增,培养的细胞可用于自体组织工程皮肤的构建。     

rhKD/APPvar对实验性急性肝损伤小鼠肝细胞增殖能力的影响

目的探讨重组人淀粉样蛋白前体Kunitz型蛋白酶抑制剂结构域变异体(Reorganization human Kunitz protease inhibitor domain of amyloid protein precursor variant,rh KD/APPvar)对实验性急性肝损伤小鼠肝细胞增殖能力的影响。方法利用实验鼠的四氯化碳(CCl4)慢性肝损伤模型,采用免疫组化方法,检测各组增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)阳性细胞数。结果正常对照组的PCNA阳性细胞数为(2±2)个/视野,模型组的PCNA阳性细胞数为(6±3)个/视野,rh KD/APPvar小、中、大剂量组的PCNA阳性细胞个数分别为(29±110)个/视野、(38±10)个/视野、(55±12)个/视野,抑肽酶组的PCNA阳性细胞个数为(24±9)个/视野,rh KD/APP组的PCNA阳性细胞个数为(19±5)个/视野。与模型组相比,rh KD/APPvar各剂量组PCNA阳性细胞数目均显著增加(P<0.05),并且存在剂量依赖关系。rh KD/APPvar各剂量组阳性细胞数多于抑肽酶组。结论 rh KD/APPvar能够促进急性肝损伤小鼠肝细胞增殖,其作用随着剂量的增加而增强。     

秦皮提取物对实验性脂肪肝的治疗作用及其机制

目的研究秦皮提取物对实验性脂肪肝的治疗作用并对机制进行初步探讨。方法采用薄层层析硅胶法分离纯化秦皮,得到秦皮提取物,采用Wistar大鼠作为实验动物,设立脂肪肝模型组,正常饮食对照组和秦皮实验组,进行灌胃治疗。进而对肝细胞分泌型TG和ApoB以及肝细胞微粒体腔VLDL中TG和ApoB进行含量测定。结果秦皮提取物组大鼠肝分泌型TG和ApoB的含量较模型组明显降低(P<0.05),并呈剂量依赖关系,秦皮提取物组大鼠肝细胞微粒体腔VLDL中TG和ApoB的含量较模型组明显降低(P<0.05),并呈剂量依赖关系,与正常对照组相比没有显著差异。结论秦皮提取物对大鼠实验性脂肪肝具有一定的治疗作用,其机制可能与抑制TG、ApoB的生成及转运有关。     

应用同种异体组织工程软骨修复关节软骨缺损观察

目的用胶原蛋白和人血纤维蛋白混合物为载体支架在体外进行软骨细胞三维立体培养,构建人工软骨组织,利用此人工软骨修复关节软骨缺损。方法取2周龄兔关节软骨,经消化、分离的软骨细胞体外培养。培养第3周时,进行免疫组织化学分析;利用培养3周的人工软骨对异体成兔的关节软骨损伤进行修复。结果培养物内软骨细胞均得到较好存活,形成软骨陷窝,出现同源性细胞簇,分泌软骨基质;DNA和糖胺多糖(GAG)在培养第24天时达到高峰,分别为(5.18±0.19)、(214.3±2.8)μg/块;对异体关节软骨损伤的移植修复结果良好,在12周时,移植物与周边正常组织结合紧密、齐高,移植的软骨细胞趋于柱状排列,为透明软骨组织。结论用胶原蛋白和人血纤维蛋白为载体支架体外培养软骨细胞,可构建较大的组织工程软骨,能较好地修复同种异体关节软骨缺损。     

胶原纤维与软骨细胞体外培养的实验研究

目的　研究应用胶原纤维作为组织工程技术中细胞培养支架的可行性。方法　未经预湿和经预湿处理的胶原纤维支架与人胚关节软骨细胞体外培养 ,采用光镜和电镜观察其亲水性及对细胞吸附力和细胞功能的影响。结果　软骨细胞均匀地分布于胶原纤维支架内 ,经预湿处理后的支架细胞分布更为迅速均匀 ;软骨细胞吸附于支架纤维表面 ,细胞生长代谢旺盛 ,合成分泌细胞外基质。结论　胶原纤维支架具有良好的亲水性 ,有利于软骨细胞的吸附和生长 ,可以作为组织工程技术中细胞培养的支架材料。     

重组牛胰蛋白酶抑制剂对四氯化碳致大鼠慢性肝损伤的保护作用

目的观察重组牛胰蛋白酶抑制剂(rBPTI)对大鼠慢性肝损伤的保护作用。方法大鼠98只,随机分成7组,分别为正常对照组、模型组、rBPTI3个剂量组(20,40和80MU.kg-1)、抑肽酶组(80MU.kg-1)和促肝细胞生长素组(100mg.kg-1)。除正常对照组外,其余各组皮下注射四氯化碳制备慢性肝损伤模型。8周后每天ip给药,给药4周后测定血清谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)活性、白蛋白(Alb)含量、白蛋白/球蛋白(A/G)比值、唾液酸(SA)含量及肝组织羟脯氨酸(Hyp)含量,并进行组织病理学检测。结果与正常对照组比较,模型组大鼠血清GPT和GOT活性、SA含量及肝组织Hyp含量明显升高,血清Alb含量和A/G比值明显降低。与模型组比较,rBPTI各剂量组大鼠血清GPT和GOT活性、SA含量及肝组织Hyp含量降低,血清Alb含量和A/G比值明显增高。肝组织病理观察显示,rBPTI明显减轻由四氯化碳所致肝细胞脂肪变性及纤维组织增生等病理改变。结论rBPTI对四氯化碳诱导的大鼠慢性肝损伤具有保护作用和抗纤维化作用,在所观察的剂量范围内作用效果与抑肽酶相当。     

以纤维蛋白为基质网架的组织工程角膜上皮的构建

目的：应用组织工程技术以纤维蛋白为基质网架、角膜缘干细胞为种子细胞构建组织工程角膜上皮，为角膜上皮移植提供新的移植材料。方法：将20 g•L^-1的纤维蛋白原溶液和含有10 U•mL^-1凝血酶的催化剂溶液混合构成纤维蛋白基质网架，检测支架材料的一般结构和超微结构；取2 mm×2 mm角膜缘组织，胰蛋白酶消化后移至纤维蛋白胶上培养，观察角膜上皮干细胞的生长情况，2周后进行形态学、超微结构和免疫组织化学观察。结果：纤维蛋白基质网架柔软有伸拉性，孔径70～108 μm，平均三维空孔率为70.4%；扫描电镜下呈多层次网络状；接种36 h后，细胞从组织块边缘迁移，7 d后细胞几乎铺满整个培养板孔底，14 d左右细胞与纤维蛋白胶体形成复合植片。透射电镜下观察仍维持上皮细胞特有的超微结构特征。抗细胞角蛋白K3单克隆抗体AE5和抗p63的单克隆抗体4A4免疫组织化学染色均为阳性。 结论：纤维蛋白可作为角膜上皮干细胞移植的良好支架材料，可为组织工程角膜上皮提供新的移植材料。     

壳多糖基质网架复层组织工程皮肤的动物移植实验

背景：治疗由烧伤或疾病等引起的大面积全层皮肤缺失最为常见的和有效的方法就是皮肤移植修复，但目前面临的最大障碍是皮肤供体不足。以自体皮肤细胞作为种子细胞构建的组织工程皮肤是解决这一矛盾的最理想途径。目的：探讨组织工程皮肤动物移植实验的效果。设计：随机对照实验。单位：一所大学再生医学科学研究所及皮肤科。材料：实验于1998—09／2001—07在吉林大学细胞工程研究室完成。选用新生Wistar大鼠20只；8周龄雄性裸鼠24只。方法：应用以壳多糖为基质网架构建的组织工程化复层人工皮肤，对裸鼠大面积(直径20mm)全层皮肤缺损模型进行移植修复。24只8周龄裸鼠分为组织工程皮肤移植(artificial skin，AS)组、壳多糖膜覆盖物(chitosan，CH)组及对照组(control gmup，CG)，术后进行大体观察，并在3，7，14和21d应用组织学、红外热像扫描分析等手段对修复组织进行动态监测。主要观察指标：①实验动物大体观察情况。②修复区血供情况的红外热像观察。③组织学观察。结果：AS组在移植第3天，移植的组织工程皮肤与自体皮肤能够很好地融合，有少量毛细血管长人移植物，皮肤移植物颜色与自体皮肤颜色接近；随着时间的延长，移植物中毛细血管的数量逐渐增多，表皮层清晰可见基底层、棘细胞层、颗粒层和角质层，角化现象加强，有角化物脱落；真皮层细胞数量增多，网架逐渐降解，分泌的细胞外基质成份增多；第14天，创面基本愈合；修复区皮肤颜色与正常皮肤颜色非常接近，瘢痕很小，无需进行二次植皮。至移植的第14天，CH组结痂未完全脱落，创面未愈合，颜色较AS组深。对照组的结痂脱落，创面大而深。颜色深红。结论：以壳多糖为基质网架构建的组织工程皮肤具有良好的组织相容性，可应用于皮肤缺损的移植修复。     

rhKD/APP var在慢性肝损伤中的保护作用

目的探讨重组人淀粉样蛋白前体K／mitz型蛋白酶抑制剂结构域变异体（reorganization human Kunitz protease inhibitor domain of amyloid protein precursor variant，rhKD／APPvar）对实验鼠慢性肝细胞损伤的保护作用。方法利用四氯化碳建立Wister大鼠慢性肝损伤实验动物模型，并给予rhKD／APPvar观察其对实验鼠血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、白蛋白（ALB）、白蛋白／球蛋白（A／G）、唾液酸（SA）、胆碱酯酶（CHE）、碱性磷酸酶（ALP）、肝组织羟脯氨酸（hydroxyproline，Hyd）含量以及肝组织的病理改变的影响。结果rhKD／APP明显降低血清ALT、AST、ALP，明显增高血清ALB、A／G、SA、CHE值。肝组织Hyd明显降低。鼠肝组织病理性改变明显减轻。结论rhKD／APP-var对大鼠慢性肝损伤具有明显的保护作用。     

负载舌鳞癌抗原的树突状细胞抗肿瘤的实验研究

目的探讨针对舌鳞癌的特异性免疫治疗作用。方法培养舌鳞癌细（Tca8113），43℃热后提取抗原并与树突状细胞（DC）共同培养，检测其对舌鳞癌细胞的特异性杀伤活性。结果负载抗原的DC对舌鳞癌细胞的杀伤活性明显高于未负载抗原的DC。结论DC负载抗原后可明显提高其抗肿瘤活性。