改变PTEN基因表达影响支气管平滑肌细胞增殖

目的:通过基因过表达和RNA干扰(RNAi)技术改变PTEN基因的表达并观察其对人支气管平滑肌细胞(BSMC)增殖和相关信号通路的影响。方法:利用携带野生型PTEN基因的重组腺病毒(Ad-GFP-PTEN)和针对PTEN基因的腺病毒短发夹状RNA(shRNA)载体(Ad-GFP-shRNA-PTEN),转染BSMC细胞,建立PTEN基因过表达细胞模型Ad-GFP-PTEN-BSMC和PTEN基因沉默细胞模型Ad-GFP-shPTEN-BSMC,并以感染Ad-GFP和空白组作为对照。通过荧光倒置显微镜检测转染效率;Westernblot法检测PTEN蛋白的表达和AKT、ERK1/2通路的活化情况;MTS/PMS法检测细胞生长的变化;PI单染流式细胞术检测细胞周期的变化。结果:腺病毒介导的过表达载体和shRNA载体都能有效改变PTEN基因的表达。PTEN基因表达上调后,BSMC细胞生长受到抑制,G0-G1期细胞增多,S期细胞和G2/M期细胞减少,PI3K/AKT通路受到抑制,而MAPK/ERK通路未见变化;PTEN基因表达下调后,BSMC细胞生长受到促进,S期细胞增多,G0-G1期细胞和G2/M期细胞减少,PI3K/AKT通路激活,但MAPK/ERK通路却受到抑制。结论:PTEN基因可能主要通过调节PI3K/AKT通路影响人支气管平滑肌细胞的生长。     

PTEN重组腺病毒载体的构建及其在气道平滑肌细胞的表达

目的 应用pAdxsi载体系统构建携带PTEN基因的腺病毒载体.方法 将PTEN cDNA自载体pcDNA3-PTEN中切出,克隆至穿梭质粒pShuttle-GFP-CMV中,然后与腺病毒质粒pAdxsi在化学感受态细胞DH5α菌株内同源重组,经Pac-Ⅰ线性化后,重组子通过脂质体2000介导转染HEK293细胞,产生有感染能力的腺病毒,并测定其滴度,通过荧光显微镜能观察HEK293细胞内绿色荧光的表达;PCR检测腺病毒载体PTEN mRNA的表达,Western blotting检测PTEN蛋白在气道平滑肌细胞的表达.结果 感染腺病毒载体的HEK293细胞表达GFP随着时间逐渐增强,并且出现明显的细胞病变效应,经过3轮扩增后病毒达到合适的滴度,构建的Ad-PTEN腺病毒滴度为2×1010pfu/ml,PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳证实其表达,Western blotting检测纠腺病毒感染的气道平滑肌细胞内PTEN蛋白表达明显增高.结论 成功构建了携带野生型PTEN腺病毒载体,为进一步研究PTEN基因应用于哮喘治疗提供了实验基础.     

血清降钙素原和C-反应蛋白检测对老年肺炎病情及预后价值

目的 观察血清降钙素原(PCT)和C-反应蛋白(CRP)检测对老年肺炎病情严重程度及预后的评估价值.方法 选择我院感染内科2014年6月至2016年6月间收治的62例老年肺炎患者作为观察组,根据其病情严重程度划分为低危组(30例)、中危组(21例)及高危组(11例),并随机选择同期就诊的28例老年健康体检者作为对照组,分别检测老年肺炎患者及健康体检者的血清PCT、CRP水平,并观察其预后情况.结果 观察组血清PCT、CRP水平高于对照组,且低危、中危及高危患者上述指标比较有显著差异(P＜0.05);高危组住院时间、抗生素使用时间长于中危组及低危组,重症肺炎转化率及死亡率显著高于低危组(P均＜0.05),而中危组上述指标虽大于低危组,但比较无显著差异(P＞0.05).结论 PCT、CRP水平检测对于判断老年肺炎患者的病情及预后具有一定作用,可指导临床治疗.     

重组腺病毒介导的绿色荧光蛋白基因转染体外培养的人气道平滑肌的实验研究

目的:研究重组腺病毒载体介导的绿色荧光蛋白基因转染体外培养的人气道平滑肌(HASMCs)的方法。方法:用组织贴块原代培养传代至3～8代的HASMCs,重组绿色荧光蛋白基因的腺病毒载体(Ad-GFP)以不同的感染复数(multiplicity of infection,MOI)转染,荧光显微镜和流式细胞术检测其转染效率,CCK-8法检测其对细胞的毒性。结果:随着MOI增高,转染效率增高。MOI=100时Ad-GFP对HASMCs的感染效率可达(96±0.32)%,以感染后48h达高峰,持续7d仍有绿色荧光表达;转染后的细胞与未转染细胞相比,细胞毒性无统计学差异(P>0.05)。结论:重组腺病毒载体介导的绿色荧光蛋白基因Ad-GFP能高效转染HASMCs,转染后对细胞无毒性,是一种安全的基因载体。     

IL-22对人气道细胞的作用

目的 探讨IL-22对人气道上皮细胞、气道平滑肌细胞、气道成纤维细胞的生理学作用.方法 用实时定量PCR 检测气道上皮细胞、气道平滑肌细胞、气道成纤维细胞哮喘血清刺激前后IL-22R1 mRNA表达的变化.不同浓度的IL-22(10 ng/ml,100 ng/ml,1 000 ng/ml)刺激气道上皮细胞、气道平滑肌细胞和气道成纤维细胞后,用MTT法检测细胞的增殖,用流式细胞技术(FACS)检测细胞的凋亡和坏死.结果 哮喘血清刺激后气道上皮细胞IL-22R1 mRNA表达降至正常对照组的9%,气道平滑肌细胞IL-22R1 mRNA表达升高至正常对照组的345倍,而气道成纤维细胞IL-22R1 mRNA表达无明显变化.高剂量(1 000 ng/ml)的IL-22刺激气道上皮细胞和气道成纤维细胞12、24 h可显著降低细胞增殖(P<0.05,P<0.01).三种不同浓度的IL-22刺激气道上皮细胞24 h后均导致细胞凋亡显著下降(P<0.05),低浓度的IL-22(10 ng/ml)导致细胞坏死增加(P<0.01).不同浓度的IL-22刺激气道平滑肌细胞后,细胞凋亡和坏死无显著性变化.中、高浓度IL-22(100 ng/ml,1 000 ng/ml)刺激气道成纤维细胞后,细胞坏死率显著下降(P<0.05).结论 IL-22在支气管哮喘中对气道上皮的作用具有双重性,并与支气管哮喘的病程相关;而对气道平滑肌细胞的作用则可能与浓度及病程相关.支气管哮喘后续阶段,IL-22对气道成纤维细胞作用轻微.     

PTEN基因表达改变对人气道平滑肌迁移的影响

目的通过腺病毒载体体外转染人气道平滑肌细胞(HASMC),使肿瘤抑制基因PTEN过表达和RNA干扰表达,观察其对HASMC迁移的影响,并探讨其作用机制。方法利用携带野生型PTEN基因的重组腺病毒(Ad-GFP-PTEN)和针对PTEN基因的腺病毒短发夹状RNA(shRNA)载体(Ad-GFP-shRNA-PTEN)转染HASMC细胞,并以感染空载腺病毒Ad-GFP和空白组(DMEM)作为对照,用流式细胞计数确立最佳转染复数后,通过Transwell趋化小室和细胞划痕实验检测HASMC跨膜迁移能力和横向迁移能力的变化。Western blotting检测PTEN蛋白的表达和AKT、ERK1/2通路的活化情况,并加入两通路的抑制剂作为阳性对照。结果腺病毒搭载的PTEN基因过表达和干扰载体能成功改变PTEN基因的表达。上调PTEN表达能显著抑制HASMC迁移;蛋白水平上抑制PI3K/AKT通路,而MAPK/ERK通路未见变化。下调PTEN表达不能明显促进HASMC迁移;但在蛋白水平能使PI3K/AKT通路激活,而MAPK/ERK通路却受到抑制。结论上调PTEN表达能有效抑制HASMC的迁移,可能主要是通过抑制PI3K/AKT通路起作用。     

PTEN基因重组腺病毒对人气道平滑肌细胞增殖的影响及其作用机制

目的 观察携带野生型PTEN基因的重组腺病毒(Ad-PTEN)体外转染人气道平滑肌细胞(HASMC)后的表达,研究其对HASMC增殖的影响,并对其作用机制作初步的探讨.方法 利用pAdxsi载体系统构建携带PTEN基因的腺病毒载体,体外转染HASMC,荧光显微镜观察Ad-PTEN的转染效率.RT-PCR及Western blotting检测PTEN在HASMC中的表达.采用MTS/PMS法检测细胞增殖,流式细胞仪测定细胞周期分布.Western blotting检测Akt及p-Akt的表达,RT-PCR检测P2lmRNA的表达.结果 外源性野生型PTEN基冈经腺病毒介导成功转入HASMC,当感染复数MOI为100时,体外转染效率高达98%以上.Ad-PTEN感染HASMC后,能有效地引起细胞内过度表达PEEN.上调PTEN表达能显著提高G0/G1期细胞的比例,抑制细胞的增殖.上调PTEN表达能显著降低p-Akt及提高P21的表达水平.结论 成功构建了过度表达PTEN的原代培养HASMC模型,该模型能有效地引起细胞内过度表达PTEN.上调PTEN表达能有效抑制HASMC的增殖,可能是通过对P13K/AKt信号通路的抑制及上调P21的表达而起作用的.     

重组人脑利钠肽治疗慢性肺源性心脏病心力衰竭的效果观察

目的观察重组人脑利钠肽（rhBNP）治疗慢性肺源性心脏病（CPHD）心力衰竭的临床效果。方法对我院2010年1月至2011年12月住院的56例CPHD心力衰竭患者随机分为研究组和对照组,两组均给予吸氧、抗感染、营养支持及并发症治疗。研究组在此基础上给予rhBNP治疗,观察两组临床症状、体征及心、肺功能改善的情况。结果研究组肺动脉压治疗前、后分别为（39．7±6．2）、（26．5±3．8）mmHg,两者比较差异有统计学意义（t=14．992,P=0．000）;对照组肺动脉压治疗前、后分别为（38．4±5．1）、（31．5±4．5）mmHg,两者比较差异有统计学意义（t=9．378,P=0．000）;两组治疗后比较差异有统计学意义（t=-9．742,P=0．000）。研究组B型脑钠肽（BNP）治疗前、后分别为（873．0±12．9）、（382．0±11．4）ng／L,两者比较差异有统计学意义（t=353．627,P=0．000）;对照组BNP治疗前、后分别为（862．0±12．3）、（568．0±12．6）ng／L,两者比较差异有统计学意义（t=156．135,P=0．000）;两组治疗后比较差异亦有统计学意义（t=-103．490,P=0．000）。研究组治疗前、后左心室射血分数分别为（38±9）％、（65±8）％,两者比较差异有统计学意义（t=-23．056,P=0．000）;对照组治疗前、后左心室射血分数分别为（32±7）％、（47±5）％,两者比较差异有统计学意义（t=-16．485,P=0．000）;两组治疗后比较差异亦有统计学意义（t=18．308,P=0．000）。研究组24h尿量治疗前、后分别为（0．9±0．4）、（1．6±0．3）L,两者比较差异有统计学意义（t=-17．320,P=0．000）;对照组24h尿量治疗前、后分别为（0．9±0．2）、（1．0±0．6）L,两者比较差异有统计学意义（t=-5．250,P=0．000）;两组治疗后比较差异亦有统计学意义（t=6．592,P=0．000）。研究组总有效率为82．2％（23／28）,对照组总有效率为57．1％（16／28）,两组比较差异有统计学意义（x2=4．139,P〈0．05）。结论rhBNP能有效改善CPHD心力衰竭患者的心功能。     

老年患者下呼吸道铜绿假单胞菌感染临床分布与耐药性分析

目的:分析老年患者下呼吸道铜绿假单胞菌感染临床分布与耐药性。方法:搜集2011年6月至2013年6月我院老年下呼吸道感染住院患者,分离培养出铜绿假单胞菌菌株痰标本156份,用VITEK2-Compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统对临床标本中分离的156株铜绿假单胞菌进行鉴定,并采用琼脂扩散法进行体外药敏试验,依据美国临床实验室标准化协会(CLSI)最新折点判读结果。结果:非多重耐药(MDR)铜绿假单胞菌临床分离株对头孢噻肟、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶耐药性最高,耐药率达70%以上;对亚胺培南、美罗培南、氨曲南和头孢哌酮/舒巴坦、头孢他啶、哌拉西林/舒巴坦、阿米卡星的耐药率均在20%以内,其中亚胺培南、美罗培南敏感性均达到100%。而MDR菌株对哌拉西林、头孢噻肟、庆大霉素、环丙沙星、妥布霉素、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶高度耐药,耐药率达100%,对哌拉西林/他唑巴坦、头孢吡肟、阿米卡星耐药率高达60%以上,对亚胺培南、美罗培南、氨曲南依旧敏感性较好,耐药率均低于20%。结论:亚胺培南、美罗培南对铜绿假单胞菌有较好的敏感性,可作为老年患者重症下呼吸道铜绿假单胞菌感染治疗的首选药物,如MDR铜绿假单胞菌感染,可联合用药。在联合用药的同时应当加强医院的抗生素合理使用,规范临床用药。