结构分析技术及其在重组疫苗质量研究中的应用

由于重组疫苗抗原结构以及生产工艺的复杂性，对疫苗的质量控制提出了更高的要求。重组疫苗抗原保持天然构象的程度直接决定其诱导免疫应答的程度，从而最终影响疫苗的有效性。对抗原开展多角度、多尺度、多方位的结构研究不仅能够完成抗原的结构确证，还有助于了解产品的关键质量属性，从而建立有效的质量控制体系。此文综述了三维结构测定、抗原表位鉴定及颗粒性分析等多种结构分析技术，以及结构分析在重组疫苗质量研究中的应用。     

抗柯萨奇病毒A组10型中和抗体检测用毒株的应用研究

目的 研究抗柯萨奇病毒A组10型（Coxsackievirus A10,CV-A10）中和抗体检测用毒株的应用。方法 对CV-A10毒株进行扩增培养,建立3级种子批并进行相关检定。采用3人3次独立测定病毒滴度,对工作种子批进行滴度标定,通过分别与肠道病毒71型（enterovirus A71,EV-A71）、CV-A16、CV-A6免疫血清进行交叉中和反应,评价该毒株的专属性。对CV-A10自然感染人血清和CV-A10小鼠免疫血清样品进行中和抗体效价检测,对其应用进行评价研究。结果 获得一株CV-A10中和抗体检测用毒株,3级种子批的无菌检查、支原体检查等项目均符合中国药典2020年版三部相关要求;经标定,平均病毒滴度为7.903 lg半数细胞培养物感染量（50% cell culture infectious dose,CCID₅₀）/ml（95%置信区间：7.868~7.937 lgCCID₅₀/ml）,变异系数为1.10%;与EV-A71、CV-A16、CV-A6免疫血清无交叉反应,专属性良好;检测CV-A10自然感染人血清和CV-A10小鼠免疫血清,中和抗体的最大值与最小值倍数差均小于4,中和抗体检测变异系数分别为6.38%和3.64%。结论 抗CV-A10中和抗体检测用毒株具有较好的专属性可很好的应用于后续抗CV-A10中和抗体的相关检测。     

肠道病毒A组71型病毒参考品的建立及应用

目的 建立肠道病毒A组71型（enterovirus A71,EV-A71）灭活疫苗病毒参考品,用于病毒滴度内部质控品及灭活效果验证实验室评价。方法 建立1批病毒参考品,按照《中华人民共和国药典》对其进行检定,包括无菌、支原体及分子生物学鉴定检查等。对其滴度进行标定和储存稳定性研究,并进行病毒滴定和灭活效果验证方面的应用研究。结果 建立的EV-A71病毒参考品无菌检查及支原体检查结果均符合规定。分子生物学鉴定结果显示参考品只含有单一的EV-A71 VP1特异性条带。EV-A71病毒参考品标定后的滴度平均值为7.000 lgCCID50/ml(95%CI为6.917～7.083 lgCCID50/ml),可接受范围为6.566～7.434 lgCCID50/ml,变异系数（coefficient of variation,CV）为3.01%,于-60℃及以下存放12个月的CV为2.08%,稳定性良好。将参考品作为病毒滴定测定的内部质控品应用于日常监测50次试验,滴度趋势分析结果显示未出现超趋势现象（out of trend,OOT）且均在警戒限内;将参考品作为阳性对照应用于灭活效果验证,...     

重组肠道病毒71型疫苗（汉逊酵母）抗原冻干参考品的制备及稳定性研究

目的  制备重组肠道病毒71型（enterovirus A71，EV-A71）疫苗（汉逊酵母）抗原冻干参考品，用于重组EV-A71疫苗（汉逊酵母）的抗原含量测定。方法  选取检定合格的重组EV-A71疫苗（汉逊酵母）原液，加入冻干保护剂，冷冻干燥制备重组EV-A71疫苗（汉逊酵母）抗原冻干参考品，对其进行保护剂抗原含量标定，并对其进行反复冻融试验，37 ℃、2~8 ℃和-20 ℃稳定性研究。结果  制备的抗原冻干参考品鉴别试验、无菌检查结果均符合规定，水分含量为1.4%。经标定，几何均值为2 146 U/ml，几何变异系数为7.2%。10次反复冻融，抗原含量仍无明显变化；37 ℃放置3个月，抗原含量无明显变化；2~8 ℃和-20 ℃分别放置30个月，抗原含量仍较为稳定。 结论  制备了一批稳定的、均一性良好的抗原冻干参考品，可以用于重组EV-A71型疫苗（汉逊酵母）抗原含量测定。     

甲型H1N1流感病毒HA63-286蛋白的原核表达及免疫原性初步研究

近年来,随着甲型H1N1流感的不断暴发,对新型流感疫苗的开发和安全应用越来越得到重视.对甲型H1N1的血凝素(HA)第63～ 286氨基酸区进行基因克隆,并将其插入到大肠杆菌表达载体pTXB1中进行表达,对其免疫原性进行了初步的研究,为开展基因工程疫苗和核酸疫苗研究提供了资料.     

肠道病毒71型病毒样颗粒在汉逊酵母中的表达

目的应用汉逊酵母表达系统进行肠道病毒71型（EV71）病毒样颗粒（VLP）的表达。方法将经过汉逊酵母密码子优化的人EV71的 P1和3CD基因片段克隆到汉逊酵母表达载体PMV上,获得重组表达质粒PMV-P1-3CD,转化汉逊酵母宿主菌AU0501,PCR方法及稳定传代培养筛选整合P1和3 CD基因的重组菌株。重组菌种接种在含有1％甲醇的培养基中进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE、Western blot检测。挑选优胜表达菌株进行30 L发酵罐发酵培养,发酵产物经过粗略纯化后进行电镜分析。结果筛选获得EV71重组表达菌株;SDS-PAGE检测结果显示在相对分子质量（Mr）为26×103、33×103、35×103处有明显的VP3、VP1、VP0蛋白条带,Mr 大小与预期的目的蛋白大小一致;Western blot检测结果显示表达产物与EV71-VP1单克隆抗体在M r 为33×103处有较为明显的VP1反应条带,表达产物具有良好的免疫反应性;表达菌株发酵表达量可达200 mg/L,电镜分析可见24～30 nm的VLP,且颗粒结构完好。结论应用汉逊酵母表达系统成功表达了EV71 VLP,为今后研制EV71 VLP疫苗奠定基础。     

Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗宿主细胞DNA残留量检测方法研究

目的 建立Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗Vero细胞DNA残留量的检测方法.方法 提取Vero细胞基因组DNA,制备地高辛标记探针.比较样品不同处理方式的检测差异.对建立的残留DNA检测方法进行特异性、灵敏度和稳定性验证.结果 Vero细胞基因组DNA的质量浓度为295 μg/ml,260nm与280nm波长处的吸光度比值为1.88.探针灵敏度达到0.01 pg/μl.采用苯酚抽提方式处理DNA参考品,检测灵敏度为1 ng;而用碘化钠处理DNA参考品,灵敏度达到10 pg.特异性检测表明,探针与非同源DNA无杂交.灵敏度和稳定性检测结果显示,探针于-70℃保存9个月,灵敏度仍为10 pg.结论 建立了Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗Vero细胞DNA残留量的检测方法.采用碘化钠提取DNA,回收率高,操作简单,适用于Vero细胞的残留DNA检测.