重组人乳头瘤病毒11型L1蛋白在昆虫细胞sf 9中的表达条件优化研究

目的 确定利用昆虫细胞一杆状病毒表达系统表达重组人乳头瘤病毒11型L1蛋白(HPV11 L1)的最适表达条件.方法 通过间接免疫荧光法鉴定目的蛋白表达情况;用蛋白印迹法(Western blot)确定在不同感染复数(MOI)、不同表达时间条件下目的蛋白的最适表达条件.结果 当sf9细胞密度为2.0×106/ml时,以MOI值为2.0的重组杆状病毒接种,悬浮表达96 h收获为最适表达条件.结论 确定了目的蛋白的最适表达条件,为进一步大量表达及纯化提供参考.     

重组人乳头瘤病毒58型L1蛋白在Sf9细胞中的表达条件优化

目的 采用昆虫细胞-杆状病毒表达系统扩增人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)58型L1蛋白基因,确定L1蛋白表达的最佳条件.方法 取处于埘数生长期的S19细胞以不同的感染复数(MOI)值扩增病毒,用噬斑试验检测病毒滴度,确定扩增重组病毒的最适条件;用间接免疫荧光法判断目的蛋白表达情况;通过蛋白印迹法测定不同的表达时间和MOI值条件下目的蛋白表达量,确定目的蛋白的最佳表达条件.结果 处于对数生长期的细胞以MOI值为0.5表达48 h条件下扩增含HPV58 LI基因的重组杆状病毒,滴度最高,可达5×108pfu/ml;以MOI值为5.0表达72 h获得最佳的目的蛋白表达量.结论 确定了扩增病毒和表达相应目的蛋白的最佳条件.     

重组人乳头瘤病毒58型L1蛋白在Sf9细胞中的表达条件优化

Objective To select the optimum conditions for amplification and expression of the recombinant human papillomavirus 58 (HPV58) LI gene using baculovirus-insect cell expression system. Methods The Sf9 insect cells at logarithmic phase was used to amplify virus at different multiplicities of infection (MOI). Titers of the virus were determined by plaque assay. The expression of recombinant protein was identified by indirect immunofluorescence assay, and the expression of recombinant protein at different MOI and time was determined by Western blot. Results Recombinant baculovirus containing HPV58 LI gene were amplified at MOI of 0.5 for 48 h when the Sf9 insect cells were at logarithmic phase, and the highest titers of the virus reached 5×108 pfu/ml. The optimum conditions for expressing the recombinant protein were that the recombinant baculovirus was inoculated at MOI of 5.0 and the protein was expressed within 72 h. Conclusion The optimum conditions for amplifying the virus and expressing the recombinant protein are determined.     

含编码人乳头瘤病毒18型L1蛋白基因的杆状病毒扩增及相应蛋白表达的条件优化

目的 确定以昆虫细胞sf9扩增含编码人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)18型L1蛋白(HPV18 L1)基因的杆状病毒以及相应蛋白表达的最佳条件.方法 以对数生长期的sf9细胞在不同感染复数(MOI)和不同时间条件下扩增病毒,以蚀斑试验检测病毒滴度,选择获得最高滴度病毒的最佳条件;再以sf9细胞在不同细胞密度、不同MOI值和不同时间条件下表达相应蛋白,以蛋白印迹法鉴定并比较不同条件下的蛋白表达量,选择获得最大量目的 蛋白的最佳条件.结果 对数生长期的sf9细胞在MOI值为0.50、扩增时问为48 h时,所扩增的病毒滴度最高,可达3×108 pfu/ml;在细胞密度为3×106/ml、MOI值为2.0、表达时间为72 h时,所表达的蛋白量最大,约5 mg/L.结论 确定了含编码HPV18 L1基因的杆状病毒扩增及相应蛋白表达的最佳条件.     

重组人干扰素β1b活性标准品的稳定性研究

目的 评价重组人干扰素β1b(recombinant human interferon β1b,rhIFN-β1b)活性标准品在不同贮存温度条件下的稳定性.方法 检测在不同贮存温度(37 ℃、室温、4和-20 ℃)条件下放置不同时间段的rhIFN-β1b活性标准品的外观、溶解性、水分、pH值及生物学活性.结果 活性标准品分别在4种温度条件下放置90周生物学活性都没有降低的趋势,并且没有明显差别,同时水分、pH值等都符合规定.结论 说明辅料配方合理,可有效保护rhIFN-β1b,减少其降解,活性标准品稳定性良好.     

重组人乳头瘤病毒11型L1蛋白在昆虫细胞sf 9中的表达条件优化研究

Objective To determine the optimum conditions for expressing recombinant human papillomavirus 11 (HPVI1) L1 protein using haculovirus-insect cell expression system. MethodsThe expression of the recombinant protein was identified by indirect immunofluorescence assay, and the optimum conditions for expressing the recombinant protein at different multiplicities of infection (MOI) and time were determined by Western blot. Results The optimum conditions for expressing the recombinant protein were that the recombinant baeulovirus was inoculated at MOI of 2.0 when the density of sf 9 cell was 2.0 × 106/ml, and the protein was expressed through suspension culture within 96 h. Conclusions The optimum conditions for expressing the recombinant protein are determined, which is to provide reference for further expression and purification in large quantity.     

重组人乳头瘤病毒58型L1蛋白在Sf9细胞中的表达条件优化

Objective To select the optimum conditions for amplification and expression of the recombinant human papillomavirus 58 (HPV58) LI gene using baculovirus-insect cell expression system. Methods The Sf9 insect cells at logarithmic phase was used to amplify virus at different multiplicities of infection (MOI). Titers of the virus were determined by plaque assay. The expression of recombinant protein was identified by indirect immunofluorescence assay, and the expression of recombinant protein at different MOI and time was determined by Western blot. Results Recombinant baculovirus containing HPV58 LI gene were amplified at MOI of 0.5 for 48 h when the Sf9 insect cells were at logarithmic phase, and the highest titers of the virus reached 5×108 pfu/ml. The optimum conditions for expressing the recombinant protein were that the recombinant baculovirus was inoculated at MOI of 5.0 and the protein was expressed within 72 h. Conclusion The optimum conditions for amplifying the virus and expressing the recombinant protein are determined.     

重组人乳头瘤病毒16型L1 VLP的初步纯化、鉴定及免疫效果的初步研究

目的 对昆虫细胞-杆状病毒系统表达的人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)16型L1蛋白病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)进行初步纯化研究,并在小鼠中检测纯化VLP的免疫原性.方法 采用蔗糖-氯化铯密度梯度超速离心纯化方法纯化HPV16 LI VLP.对纯化得到的VLP分别进行蛋白印迹法、十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及电镜鉴定.然后用VLP免疫6周龄BALB/c小鼠.将小鼠随机分成6组(3个剂量组、2个佐剂组和1个对照组),间隔2周免疫3次,3次剂量相同.取血分离血清,采用间接ELISA法检测抗HPV16 L1 VLP抗体滴度.结果 经蔗糖-氯化铯密度梯度超速离心纯化后,用SDS-PAGE鉴定纯化的HPV16 LI VLP,纯度达到90%.电镜观察可见完整的VLP颗粒.间接EUSA检测结果显示,剂量组及佐剂组小鼠血清中均可检测到特异性抗HPV16 L1 VLP抗体,且抗体滴度随针次和剂量的增加而增高.结论 采用蔗糖-氯化铯密度梯度超速离心纯化法得到的HPV16 L1 VLP可用于免疫学初步研究.通过昆虫细胞表达产生的HPV16 LI VLP 具有较强的免疫原性,能诱导小鼠产生强的体液免疫应答.     

重组人乳头瘤病毒16型L1蛋白在昆虫细胞中的表达及条件优化研究

目的 利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达人乳头瘤病毒16型(human papillomavirus 16,HPV16)L1蛋白,并确定含编码HPV16 LI蛋白基因杆状病毒的扩增及其相应目的 蛋白表达的最佳条件.方法 在不同感染复数(MOI)、不同时间条件下扩增病毒,以蚀斑试验检测病毒滴度,研究获得最高滴度病毒的最适条件;通过对相应蛋白进行表达条件的优化,以蛋白印迹法比较蛋白表达量,确定目的 蛋白表达的最佳条件.结果 确定了扩增含编码HPV16 L1蛋白基因杆状病毒及表达相应蛋白的最佳条件,即在sf9细胞系中,以MOI值为0.10接种病毒,扩增48 h后收获病毒;以细胞密度为(2-3)×106/ml,MOI值为10.0接种病毒,悬浮表达72 h收获目的 蛋白.蛋白印迹法检测结果证实,表达的目的 条带可与HPV16 LI蛋白的单克隆抗体发生反应.结论 建立了在昆虫细胞中表达HPV16 L1蛋白的最适条件,为下一步的纯化及免疫原性研究奠定了基础.