一种人神经母细胞瘤辅酶II-依赖性视黄醇脱氢酶cDNA的克隆及特征分析

背景与目的:检测神经母细胞瘤中新的辅酶II_依赖性视黄醇脱氢/还原酶[NADP(H)_dependen tretinold ehydrogenase/reductase,NRDR]选择性剪接亚型。材料与方法:我们用NRDR特异引物,从人神经母细胞瘤细胞系SK_N_SH和SK_SY_5YcDNA中分别经PCR扩增出635bp和429bpDNA片段,测序证实635bp片段是NRDR,而429bp片段是选择性剪接新亚型。再用快速cDNA末端扩增(Rapidamplification of cDN Aends,RACE)方法得到429bp片段cDNA全长序列。用绿色荧光蛋白与新亚型的融合蛋白做亚细胞定位。结果:得到新亚型全长并命名为humanNRDRA2(hum NRDRA2)(AY616182)。已知NRDR有8个外显子,而新亚型hum NRDRA2由选择性剪接造成了第4和第6外显子丢失,从第5外显子开始读码框架前移1bp,导致随后的编码区框码漂移(frameshift),同时蛋白翻译终止信号提前出现,产生仅有188个氨基酸的蛋白,其中第137氨基酸以后的序列相对于NRDR完全发生改变,同时C_末端的过氧化物酶体定位信号_SRL丢失,却在160～176氨基酸处出现了一个细胞核定位信号。我们在ESTs库中未找到与其相同的剪接形式,提示它可能是神经母细胞瘤特有的一种NRDR剪接亚型。用GFP_NRDRA2融合蛋白做该蛋白的亚细胞定位,发现发绿色荧光的细胞均已悬浮,但悬浮状态不佳,而作为对照的NRDR另一亚型则能定位成功,提示NRDRA2蛋白可能具有一定的细胞毒性。结论:人神经母细胞瘤NRDRA2选择性剪接亚型羧基端框移突变并有核定位序列;该蛋白可能是一种细胞毒性蛋白。     

美国医师执照考试对我国医学遗传学教学的启示

介绍了美国医师执照（United States Medical Licensing Examination,USMLE）考试中与医学遗传学教学相关的大纲内容,并比较了我国医学遗传学教学范围与美国USMLE测试考点的异同。分析发现USMLE更加注重临床思维的培训以及临床案例的运用,启示国内医学遗传学教学工作应加强运用以问题为基础的教学模式（Problem—based learning,PBL）,提出邀请临床医生参加教材编写,以及在中国执业医师考试中增加医学遗传内容等建议。     

蛋白激酶Cα-cDNA对肾癌细胞786-0多药耐药基因表达的影响

目的探讨蛋白激酶Cα（PKCα）基因对肾癌细胞多药耐药（MDR）基因的影响。方法采用基因工程技术构建整合有PKCα基因和绿色荧光蛋白（GFP）基因的真核表达载体，利用脂质体介导法在体外将PKCα基因导入人肾癌786-0细胞，利用荧光倒置显微镜、Western blot方法检测基因转录和表达情况。同时检测PKCαcDNA对肾癌786-0细胞转染前后细胞中MDR相关基因MDR1、MRP1、LRP的表达变化。结果PKCα基因转染786-0细胞后，Western blot显示转基因细胞中有PKCα的高表达；荧光倒置显微镜观察证实转基因细胞中有绿色荧光蛋白的阳性高表达。RTPCR结果表明肾癌转染细胞系PKCα／786-0的MDR1表达水平高于肾癌786-0细胞。结论PKCα-cDNA可上调肾癌细胞786-0 MDR1表达量，可能导致肾癌多药耐药性的提高。     

DHRS4基因簇缺失型神经母细胞瘤细胞株的克隆和鉴定

目的 单克隆培养人神经母细胞瘤SH-SY5Y-细胞株,并鉴定其在基因水平缺失DHRS4基因簇,包括DHRS4、DHRS4L2和DHRS4L1的基因序列.方法 有限稀释法培养实验室偶得的低表达DHRS4基因的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,相差显微镜观察细胞的生长和增殖,PCR、RT-PCR检测DHRS4、DHRS4L...     

TrkA基因的表达抑制神经母细胞瘤血管生成的实验研究

目的:探讨TrkA基因通过抑制神经母细胞瘤(NB)血管生成而阻止其生长、转移的可行性.方法:常规培养对照组SY5Y细胞、TrkA基因高表达的实验组细胞(SY5Y-TrkA)和表达载体基因的空载体组细胞(SY5Y-Vec);比较三组细胞的裸鼠皮下致瘤性:通过RT-PCR、免疫组织化学、微血管面积计算检测并比较三种细胞所致的肿瘤瘤体内血管生成情况.结果:SY5Y-Trk A细胞在裸鼠皮下的致瘤性和其所致肿瘤的血管生成能力明显下降.肿瘤终体积:对照组1.736±0.485cm3,空载体组1.803±0.751cm3,实验组0.3945±0.015cm3(P＜0.01);对照组与实验组相比,血管内皮生长因子(VEGF)的表达差别显著(P＜0.01);微血管密度(MVD):对照组27.2l±14.58,空载体组27.76±14.15,实验组4.08±4.72(P＜0.01).结论:TrkA基因能有效抑制神经母细胞瘤的血管生成和肿瘤生长,为应用基因抗血管治疗神经母细胞瘤提供理论依据.     

蛋白激酶C抑制剂逆转肾癌多药耐药机制的探讨

目的探讨蛋白激酶 C 抑制剂对肾癌细胞多药耐药性的逆转作用的机制。方法应用荧光显色法、RT- PCR、Western Blot 方法检测 PKCαcDNA 对肾癌 786- 0 细胞的转染前后细胞中 MDR 相关基因MDR1、MRP1、LRP 的表达变化。采用 MTT 法测定转染细胞系 PKC- α\786- 0 与 786- 0 细胞分别对阿霉素( ADM) 与蛋白激酶 C 激动剂、蛋白激酶 C 抑制剂协同作用后的耐药性变化。结果 RT- PCR 结果显示肾癌转染细胞 PKCα\786- 0 的 MDR1 表达水平高于肾癌 786- 0 细胞。阿霉素( ADM) 与蛋白激酶 C 抑制剂协同作用的细胞系的耐药性明显降低。786- 0 细胞对阿霉素( ADM) 的 IC50 为: 7.8015e-7(5.7046e-7 至 1.0669e-6);PKCα\786- 0 对药物阿霉素( ADM) 的 IC50 为: 1.6588e-6(1.1621e-6 至 2.3677e-6); 蛋白激酶 C 激动剂 PMA 联合阿霉素处理 PKCα\786- 0 的 IC50 为: 2.6794e-6(2.0521e-6 至 3.4983e-6); 蛋白激酶 C 抑制剂 Calphostin C 联合阿霉素处理 PKCα\786- 0 的 IC50 为: 9.2506e-8(5.9337e-8～1.4422e-7)。结论蛋白激酶 C 抑制剂可以逆转人肾癌细胞的多药耐药性, 其途经可能与改变 MDR1 的表达相关。     

SYBR荧光实时定量PCR检测子宫颈鳞癌组织NRDR及其选择性剪接亚型mRNA表达

目的检测子宫颈鳞癌组织中辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶[NADP（H）-dependent retinol dehydrogenase/reductase,NRDR]及其选择性剪接亚型NRDRB1 mRNA的表达,建立SYBR实时定量聚合酶链反应（RQ-PCR）检测NRDR及其选择性剪接亚型mRNA的方法,为准确、快速分析NRDR、NRDRB1基因表达奠定基础。方法根据子宫颈鳞癌组织中NRDR、NRDRB1基因序列,设计并合成引物,将逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增的基因片段克隆至pGEM-T easy载体,重组质粒经蓝白筛选、酶切、测序鉴定后,作为阳性克隆标准品,用于标准曲线的制备,由此可定量检测出每一样品模板中NRDR、NRDRB1起始拷贝数。结果阳性克隆标准品制作的标准曲线可显示循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系（NRDR：r=0.994,NRDRB1：r=0.997）,可用于NRDR及其选择性剪接亚型基因表达的起始拷贝数定量测定。结论 RQ-PCR方法较常规PCR技术更为准确、特异、灵敏,对定量检测及研究NRDR及其选择性剪接亚型表达有积极意义。     

宫颈鳞癌组织中NRDR选择性剪接新亚型的鉴定及意义

目的:探讨NRDR选择性剪接新亚型NRDRB1 mRNA和蛋白在宫颈鳞癌组织中的表达及其临床意义。方法:采用RT-PCR、免疫荧光、免疫沉淀、免疫印迹、MALDI-TOF质谱分析等技术,检测正常宫颈上皮及宫颈鳞癌组织中NRDRB1mRNA及蛋白表达。结果:NRDRB1亚型全长1 171 bp,其蛋白保留了SDR家族的N末端辅酶结合模序、C末端底物结合模序以及过氧化物酶体定位信号。因第3外显子的缺失,导致SDR家族典型的“LVSNAA”折叠的丢失,使NRDRB1蛋白空间构象发生改变,从而影响该蛋白的细胞内定位和功能,NRDRB1蛋白的亚细胞定位明显不同于NRDR,酶活性亦明显低于NRDR。NRDRB1 mRNA及蛋白在宫颈鳞癌组织中表达(15/27,55.6%),明显高于正常宫颈上皮组织(P<0.05),正常宫颈上皮除NRDR外,未检测到NRDRB1 mRNA及其蛋白。结论:NRDR选择性剪接的异常,以及新的剪接亚型NRDRB1细胞内定位及蛋白酶活性的改变可能与宫颈鳞癌的发生发展密切相关。     

人神经母细胞瘤NRDR新剪接亚型A2的亚细胞定位

背景与目的:研究hNRDRA2在真核细胞中的定位情况,并验证其羧基端预测的核定位信号(NLS)是否能引导蛋白核输入.材料与方法:分别构建hNRDRA2和NLS的绿色荧光蛋白(GFP)融合表达载体,瞬时转染人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH、KP-N-NS及猴胚肾细胞COS-7,观察融合蛋白在3种细胞中的分布情况.结果:测序表明重组质粒构建正确,分别转染3种不同的细胞后,融合蛋白GFP-NLS表达阳性的细胞主要分布于细胞核中,GFP-A2表达阳性的细胞弥散分布于细胞质.结论:预测的NLS具有核定位功能,但携带该NLS的hNRDRA2外源表达的蛋白并不定位于细胞核.