成人肺癌切除组织和支气管切缘p53基因突变及端粒酶活性表达的研究

目的探讨肺癌切除组织和支气管p53基因突变及端粒酶活性表达,并对肺癌切除后的效果进行了评价.方法用PCR-SSCP方法,检测60例肺癌和10例肺良性肿瘤手术切除标本的支气管切缘(切缘病理切片无癌细胞残留)的p53基因突变及端粒酶活性的表达.结果在60例肺癌中有16例(26.7%)肺癌支气管切缘和30例(50.0%)肺癌组织存在p53基因突变及端粒酶活性阳性表达.肺癌切除组织基因突变及端粒酶活性表达为小细胞癌(100%)最高,次为鳞癌(70%)、腺鳞癌(60%)、腺癌(40%).p53基因突变及端粒酶活性表达与TNM分期有关.Ⅲ期(72.7%)最高,其次为Ⅱ期(58.3%),Ⅰ期(25.5%).术后随访3～8个月支气管切缘p53基因突变及端粒酶活性表达,10例(62.5%)发生支气管残端复发转移.而p53及端粒酶阴性者术后无残端癌复发.肺癌组织p53及端粒酶阳者中有20例(66.7%)在随访中发现癌复发转移,而p53及端粒酶阴性者中未发现癌复发转移.结论检测支气管切缘p53基因突变及端粒酶活性表达,作为肺癌切除后的"分子边界",可作为早期预测肺癌术后残端复发重要依据.     

食管癌手术切缘组织P^53基因突变的临床研究

目的检测食管癌手术切缘组织P53基因突变,并对食管癌切除后的效果进行评价.方法采用PCR-SSCP对60例食管癌组织、切缘组织P53基因突变进行分析(切缘病理切片无癌细胞残留).结果 60例原癌组织中有28例(45%)切缘组织检测P53基因突变,切缘组织P53突变患者预后差,其肿瘤复发率(54%)(15/28),而P53基因无突变者无1例复发.两组复发率存在显著性差异(P＜0.05).结论检测切缘组织P53基因突变为"分子定界",可作为食管癌切除后残端复发重要依据.     

五灵胶囊对正常及免疫性肝损伤小鼠IL-2、IL-6的影响

目的:探讨五灵胶囊对正常小鼠及免疫性肝损伤小鼠体内白细胞介素2（IL-2）、白细胞介素6（IL-6）活性的影响。方法:BALB/C系小鼠经脂多糖（LPS）处理和未经LPS处理,灌胃12d后,取脾脏体外培养48h、72h,收集脾细胞培养上清作用于靶细胞,分别用MTT法测定IL-2活性,用放免法测定IL-6活性。结果:五灵胶囊有促进小鼠Th细胞分泌IL-2的作用,使肝损伤所致低水平的IL-2明显升高,对损伤或正常小鼠IL-6水平无影响。结论:五灵胶囊促进IL-2分泌,调节免疫作用。     

肝卵圆细胞对肝纤维化大鼠细胞外信号调节蛋白和丝裂原激活蛋白激酶的影响

目的 观察肝卵圆细胞(hepatic oval cell,HOC)对肝纤维化(hepatofibrosis,HF)大鼠肝组织中细胞外信号调节蛋白(extracellular regulated protein kinases,ERK)和丝裂原激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,P38MAPK)信号通路蛋白的影响.方法 SD大鼠以高脂低蛋白饲养、饮用10%乙醇,皮下注射40%CCl4,隔4 d注射一次,连续8周制备HF模型.HF大鼠采用胶原酶原位灌注法分离,percall纯化原代HOC.HOC悬液0.5 ml(1×109个细胞)经门静脉植入8周HF大鼠的肝脏内,分别于8、15、30d处死大鼠,HE和Masson染色观察HF病理组织学变化,Western blot 法检测肝组织ERK与P38MAPK信号通路蛋白的表达,同时检测ALB、FGF-3、c-kit、HNF-1α、PCNA表达.结果 病理组织学显示,HOC处理组大鼠HF被部分逆转,肝组织胶原纤维增生程度明显减轻,肝组织Ras、ERK、p-ERK、c-fos、c-jun、STAT3、ALB、FGF-3、PCNA蛋白表达显著下降(分别F=91.88,36.28,54.66,93.07,64.76,58.49,52.63,20.45,27.03,均P＜0.05),而HNF-α1和c-kit表达上调(分别F=18.63,25.99,均P＜0.05).结论 HOC抑制HF活化的ERK信号通路而改善肝纤维化程度,在HOC存在条件下p-P38并不激活c-fos、c-jun、STAT3、5表达,c-kit和HNF-1α表达增加,而肝组织结构损害程度明显减轻,肝纤维化程度明显改善.

Abstract：

Objective To observe the influence of hepatic oval cell (HOC) on the expression ERK and P38MAPK signaling pathway protein in liver tissue of murine experimental hepatofibrosis (HF).Method SD rats were fed with 10% ethanol and food with high-fat and low-protein, and were injected subcutaneously with carbontetrachloride once every four days for 8 weeks to establish hepatic fibrosis. HOGs were isolated from male HF rats by collagenase porfusion of the liver. HF rats at 8th week were transplanted with 0. 5 ml HOC suspension medium at a density of 1 × 109 cell /ml via portal vein, and the rats were sacrificed at 8th, 15th, 30th day respectively. Histopathologic changes of liver tissues were observed by HE and Masson. The expression of ERK and P38MAPK signaling pathway protein were determined by Western blotting. Result Hepatofibrosis was reversed and the degree of hyperplasia fibrilcollagen in hepatic fibrosis rats decreased significantly by HOC transplantion. HOC down-regulated the protein expression of Ras, ERK,p-ERK, c-fos, c-jun, STAT3, ALB, FGF-3, PCNA ( F = 91.88,36.28,54.66,93.07,64.76,58.49,52.63,20.45 ,27.03, all P ＜ 0.05 ), up-regulated the protein expression level of HNF-α1, PDGF-Rβ significantly in liver tissues(F = 18.63,25.99,P ＜0.05). Conclusions HOC improves the degree of hepatofibrosis through inhibiting hyperplasia of collagen fibril in liver tissue of hepatofibrosis rats. With the presence of HOC the expression of c-fos,c-jun,STAT3,5 was not activated by p-P38MAPK. The expression of c-kit and HNF-1α increased and that liver tissue injury alleviated, and hepatofibrosis was improved.     

五灵胶囊调节TGF-β／Smad信号通路蛋白对胶原I、Ⅲ型表达的影响

目的探讨五灵胶囊（WL）调节肝纤维化大鼠肝组织及星状细胞（HSC）TGF-β／Smads信号转导蛋白对胶原I和Ⅲ型（COL～I、COL-Ⅲ）表达的影响。方法SD大鼠以高脂低蛋白饲养、饮用10％乙醇,皮下注射40％CCl4,隔4天注射1次,连续6周制备肝纤维化模型,灌胃给予WL3．86g／kg和秋水仙碱0．1mg／kg治疗1月;另体外分离HSC,以不同剂量的WL与HSC培养24h,最后3h加入TGF-β1 10ng／ml。实验结束后镜检肝细胞变性和肝组织纤维化程度,同时ELISA法测定血清COL-I、COL-Ⅲ和培养液COL—I含量,RT-PCR检测肝组织COL-I、COL-Ⅲ、TGF-β1 mRNA的表达。Western blot检测肝组织及HSC内COL—I、ProCOL—I、LN、α—SMA、ERK、p-ERK、TβRI、TβRⅡ、Smad2／3、Smad7蛋白表达。结果WL组大鼠肝细胞变性和肝纤维化程度明显减轻,血清COL-I、CoL-Ⅲ含量增加,COL-I、COL-ⅢmRNA表达降低。Western blot结果显示,WL能明显下调肝组织α—SMA、LN、p-ERK、TβRI、COL—I、ProCOL-I蛋白表达,对ERK、TβRⅡ、Smad2／3、Smad7蛋白表达无影响;显著下调HSCα—SMA、TβRII、p-ERK、Smad7表达,呈浓度依赖性抑制HSC分泌COL-I。结论WL抑制肝纤维化大鼠肝组织COL-I、COL-Ⅲ合成并增加COL—I降解,其作用位点是下调肝组织和HSCTGF-β／Smad、Ras／ERK信号通路蛋白p—ERK、TβRⅡ表达。     

五灵胶囊对LPS诱导枯否细胞释放细胞因子的影响

目的:探讨五灵胶囊对枯否细胞(Kupffer cells, KC)释放细胞因子介导肝细胞(hepatocellular cells, HC)损伤的作用. 方法:分离并纯化HC与KC并建立LPS及D-GlaN损伤肝细胞模型,观察五灵胶囊对2种损伤模型的作用以及对LPS诱导KC释放细胞因子介导肝细胞损伤的作用. 结果:五灵胶囊2个剂量能有效地阻滞LPS,D-GlaN损伤肝细胞以及降低LPS诱导KC释放TNF-α,IL-6,IL-8水平,抑制KC释放细胞因子损伤肝细胞. 结论:五灵胶囊遏制KC大量释放细胞因子是治疗慢性肝炎作用机制之一.     

五灵胶囊对脂多糖诱导枯否细胞内核转录因子-κB表达的作用

目的:通过体内、体外实验探讨五灵胶囊(WL)对免疫性肝脏炎症反应的作用机制。方法:制备卡介苗(BCG)+免疫佐剂+脂多糖(LPS)诱导小鼠免疫性肝损伤模型,WL灌胃给药12d,处死小鼠分离血清并制备肝组织蛋白;予大鼠WL 10、6.25g/kg灌胃4d,腹主动脉取血并制备含药血清;另取SD大鼠分离原代肝细胞和原代枯否细胞(KCs);采用Transwell小室下层培养KCs,含药血清-KCs条件培养上清对小室上层肝细胞作用。酶法测定免疫性肝损伤小鼠血清AST、ALT及条件培养上清中AST、ALT和LDH-L活性。取KCs培养成单层并同步化24h,PDTC和WL分别干预KCs 24h,再加入60μg/L的LPS诱导12h,Real-time PCR检测LPS诱导KCs表达MCP-1、IL-1、TNF-αmRNA水平,Western Blot检测免疫性肝损伤肝组织中和体外培养KCs表达TNFRⅠ、NF-κBs亚蛋白及IκKβ、IκB。结果:WL明显降低免疫性肝损伤小鼠血清ALT、AST活性并抑制肝组织内活化NF-κB信号通路;含药血清Ⅰ、Ⅱ组明显抑制活化KCs分泌促炎因子损伤肝细胞,WL抑制LPS诱导KCs表达NF-κBs信号通路蛋白,下调MCP-1、IL-1、TNF-αmRNA表达。结论:WL治疗慢性肝病炎症反应的作用机制与下调活化NF-κBs信号通路蛋白,阻滞KCs释放过量促炎因子所致肝细胞损伤相关。     

胰岛素对大鼠肝细胞损伤的保护及其抗炎机制

目的观察胰岛素对大鼠继发性肝细胞损伤是否具有保护作用并探讨其机制。方法胶原酶原位灌流分离大鼠枯否细胞(Kupffercell,KC)及肝细胞并原代培养,分别用脂多糖(LPS)及胰岛素处理KC4h,ELISA法检测KC培养上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-10(IL-10)水平;将不同处理的KC培养上清液分别作用肝细胞,12h后检测肝细胞损伤及存活率,并给予TNF-α单克隆抗体(TNF-α-mAb)阻断TNF-α,观察胰岛素对肝细胞作用的变化。结果(1)LPS处理的KC培养上清液可引起肝细胞损伤,使丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)增高;胰岛素可减轻上述肝细胞损伤(ALT活性降低30.1%,AST活性降低21.2%)(P<0.01,n=8),提高肝细胞存活率(P<0.01,n=8);(2)胰岛素降低KC培养上清液中的TNF-α水平(P<0.01,n=8),同时增加了IL-10的水平(P<0.05,n=8);(3)LPS激活的KC培养上清中加入TNF-α-mAb(中和TNF-α),亦可减轻肝细胞损伤,而此时胰岛素对肝细胞的保护效应未见叠加增强。结论首次发现胰岛素可通过抑制KC分泌促炎性细胞因子TNF-α,同时促进其释放抗炎性细胞因子IL-10,从而减轻肝细胞损伤,促进肝细胞存活。     

食管癌P53蛋白的表达与肿瘤生物学行为及预后的关系

目的探讨食管癌组织p53蛋白的过度表达与肿瘤生物学行为及预后的关系.方法应用单克隆抗p53抗体对28例食管癌组织石蜡标本进行免疫组化染色.结果 p53蛋白阳性物质位于肿瘤细胞核内,28例食管癌病例中有16例p53基因表达阳性(57%),与正常食管组织和癌旁组织比较,差异有显著性(P＜0.05),且阳性率随分化程度的降低而升高(P＜0.05).结论 p53基因的异常表达在食管癌的发展过程中起重要作用,对食管癌患者的预后判断有一定意义.     

五灵胶囊药效作用的有效成分

目的:探讨五灵胶囊产生药效作用的活性成分. 方法:分离肝细胞并建立肝细胞损伤模型,血清药效学试验证实五灵胶囊药效作用,HPLC色谱和紫外光谱分析含药血清中五灵胶囊化学成分,同时采用细胞药效学试验观察4种对照品的药效作用. 结果:模型组培养上清ALT,AST,MAO,MDA酶活性分别升高至(881.8±231.7) nkat/L, (1256.9±265.1) nkat/L, (32.3±2.3) nkat/L,(1.0±0.6) μmol/L,与正常组比较(P<0.05);五灵胶囊含药血清能有效地拮抗D-GlaN对肝细胞损伤,细胞上清液中ALT,AST,MAO,MDA酶活性分别降低至(421.8±288.4) nkat/L,(980.2±113.4) nkat/L,(21.7±5.5) nkat/L,(1.5±1.0) μmol/L,显著低于模型组(P<0.05);4种对照品能明显降低由D-GlaN诱导肝细胞损伤时所致升高的酶谱活性水平,对D-GlaN损伤的肝细胞有显著的修复和保护作用. 结论:醇甲、乙素、隐丹参酮和丹参酮ⅡA是五灵胶囊阻滞肝细胞损伤的有效活性成分.