壳聚糖生物流体敷料膜细胞毒性研究

壳聚糖为天然的海洋生物活性材料，具有良好的生物相容性，是一种应用前景十分看好的生物材料。近年来我们采用壳聚糖为主要原料研究的新型生物功能敷料（下称流体膜），不但具有较好的体外抗菌活性，而且又有止血、促上皮细胞生长及加速创面愈合等多种生物活性，为使临床应用更具安全性，特对其细胞毒性进行试验。     

米非司酮与米索前列醇联合给药安全性评价

米非司酮在临床上主要配伍米索前列醇用于抗早孕及终止排卵后的妊娠。美国食品药品管理局(FDA)在2003~2005年间共收到4例使用米非司酮出现细菌感染和脓毒血症死亡的报告,并于2005年发出公众健康通报告诫慎用米非司酮[1]。为了考察米非司酮应用安全性,我们对连续给予米非司酮和米索前列醇后实验动物可能出现的败血病症状进行了观察。1材料与方法1.1药物米非司酮片(25mg/片,浙江仙琚制药股份有限公司),米索前列醇片(200μg/片,西尔药厂)。1.2动物家兔,1.5~2.5kg,雌性,由浙江省实验动.3给药分组[2-3]家兔随机分为6组,每组4只,即非司酮口服给…     

骨髓间充质干细胞移植对大鼠脊髓半切损伤的修复作用

目的：观察骨髓间充质千细胞（MSC）移植对脊髓半切损伤大鼠运动功能的修复作用。方法：20只成年D大鼠随机分为移植组（n=10）和对照组（n=10），均进行脊髓半切损伤。伤后1周，移植组于伤处移植大鼠MSC，而对照组仅注射等量PBS。分别于移植后1天、1周、2周、3周、4周用BBB评分观测大鼠的运动功能，并于移植后4周进行损伤脊髓的大体观察和组织学检测。结果：移植后1周两组动物运动功能恢复无明显差异。移植后2周、3周、4周，与对照组比较，移植组显著提高运动功能。移植后4周，移植组损伤脊髓的结构修复明显优于对照组。结论：脊髓半切损伤大鼠经MSC移植后能明显改善其运动功能和神经形态，MSC移植对脊髓半切损伤大鼠有治疗作用。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养纯化及冻存

目的:建立大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离培养及冻存的方法。方法:用密度梯度离心法及贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓MSCs,并对其形态学特征进行观察,比较两种分离培养法的细胞生长增殖情况。大鼠MSCs在12.5%二甲亚砜(DMSO)保护下放入液氮冻存,6个月后复苏,测其成活率及观察生长增殖情况。结果:用密度梯度离心法及贴壁培养法均能有效地分离大鼠骨髓MSCs,细胞活力好,增殖能力强。大鼠MSCs可用液氮保存,且复苏后细胞生长增殖旺盛,形态无明显的变化。结论:采用密度梯度离心法及贴壁培养法成功地建立了大鼠骨髓MSCs体外分离和培养体系;采用液氮冻存大鼠MSCs的方法十分有效可行。     

不同冻存时间与温度对兔骨髓基质干细胞存活率的影响

目的:以二甲基亚砜作为保护剂,采用慢冻快融法观察不同温度及不同时间冻存的兔骨髓基质干细胞复苏后存活率的变化。方法:实验于2003-09/2005-06在浙江省医学科学院生物工程所完成。①选取清洁级3月龄新西兰大白兔5只,抽取兔髂骨及胫骨的骨髓液,密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化出兔骨髓基质干细胞,并进行增殖。②取第3代骨髓基质干细胞,经消化后离心重悬,用完全培养液调整细胞浓度为6×109L-1。将质量浓度为250g/L的二甲基亚砜缓慢滴入同体积含骨髓基质干细胞的上述培养液中,混匀,二甲基亚砜的终浓度为125g/L,骨髓基质干细胞的终密度为3×109L-1,1mL/安瓿冻存。③4℃冻存直接将安瓿置4℃冰箱中;-20℃及-60℃冻存,则将安瓿置于有脱脂棉的聚丙烯泡沫盒中,壁厚1.5cm,扎紧密封,各置-20℃及-60℃冰箱过夜,取出后分别直接放于-20℃及-60℃冰箱保存;-196℃液氮冻存,则将置有安瓿的泡沫盒于-60℃冰箱过夜后,取出冻存安瓿直接放于液氮中保存。骨髓基质干细胞分别于4℃、-20℃、-60℃、-196℃条件下进行3d,10d,1,3,8个月以及1年的冻存。④经不同温度及不同时间冻存后,给予复苏。复苏时将冻存安瓿从液氮或冰箱中取出,立即置37℃水浴并轻轻摇动,约1min迅速解冻。含骨髓基质干细胞的冻存液经5倍于冻存液量的完全培养液稀释后,离心重悬,进行骨髓基质干细胞存活率测定。复苏后的骨髓基质干细胞以1×104/cm2用完全培养液再培养,观察骨髓基质干细胞的形态变化及生长活性情况。结果:实验选取3月龄新西兰大白兔5只,全部进入结果分析。①兔骨髓基质干细胞原代培养情况:培养3d时,骨髓基质干细胞数量较少,散在分布,呈短梭形形态。培养1周时细胞形成大量的小集落,细胞变长。此后集落细胞迅速增多,逐渐汇合成片,形态为均一的长梭形,呈旋涡状排列,2周时细胞长成单层。②兔骨髓基质干细胞传代培养情况:刚传代的骨髓基质干细胞呈圆形,数小时后迅速贴壁,重新成为梭形。之后细胞呈长梭形均匀分布生长,形态比原代培养更均一,细胞生长旺盛、增殖迅速。连续传代22代无明显变化。但随传代次数增多,细胞形态出现多样性,逐渐呈老化现象。③不同温度不同冻存时间下复苏后的兔骨髓基质干细胞存活率的比较:兔骨髓基质干细胞液氮保存1年,存活率为79%;-60℃保存1,3,8个月的存活率分别为67%,38%和0%;不宜于4℃及-20℃保存。④复苏后的骨髓基质干细胞再培养情况:复苏后的骨髓基质干细胞细胞形态及生长状况与冻存前无明显差异,呈长梭形生长,增殖旺盛。结论:分离纯化的兔骨髓基质干细胞生长增殖能力强,短期保存可用-60℃冻存,长期需液氮保存,为择期进行骨髓基质干细胞实验和应用提供实验依据。     

戊型肝炎病毒IgG抗体诊断试剂盒的研制及初步应用

Objective To establish an EliSA kit for serum anti-hepatitis E virus IgG detection using recombinant antigen expressed in E. Coli. Methods Utilizing the recombinant protein ORF23 of REV expressed in E. Coli as a coating antigen, the ELISA kit for detecting serum anti-HEV IgG was established. The serum samples from 100 HEV patients and 150 negative serum samples were measured, and the detecting results was compared with those of other two HEV kits(the kits from Genelabs company and Wantai Corporation). The specificity, sensitivity and stability of the kit were evaluated. The serum samples from another 500 clinical hepatitis patients were detected to evaluate the clinical application value of this kit. Results Both the specificity and sensitivity of the kit were 100% and the consistency rates to other kits were more than 95%. The kit showed a good stability and could be stable for at least 6 months under 4 ℃. 500 samples were 145 positive in 150 hepatitis E patients, the consistency rates were 96.67% . Conclusions The ELBA kit prepared with HEV recombinant antigen has good specificity and sensitivity for detecting anti-HEV IgG in serum, and may have potential evaluation in clinical diagnosis and epidemiological investigation for hepatitis E.     

T细胞亚群测定方法的研究

近年来发现人类 T 淋巴细胞存在着功能及表面标志不同的亚群。1975年 Ferrarini用羊红细胞和 IgG 抗体致敏的牛红细胞做混合花环试验,证明正常人外周血 T 淋巴细胞中有兔 IgG 的 Fc 受体(Tr)。1975年 Moretta证明部分 T 淋巴细胞上存在着 IgM 的 Fc 受体(Tμ),且报告了这两个亚群细胞具有不同的功能,Tμ细胞具能辅助 B 细胞增殖为浆细胞,Tr 细胞具有抑制 B 细胞的作用。近5～6年来,国外普遍开展了对 T 细胞亚群的研究,国内1980年也开始有报道。     

皮肤干细胞复合壳聚糖—丝素支架移植修复大鼠皮肤缺损

由于皮肤组织结构的复杂性,单一来源的干细胞不能形成理想的完整皮肤,尤其不能形成皮肤附属器.于是出现了采用2种或更多种干细胞合用研制理想皮肤的方法.笔者以真皮间充质干细胞( DMSC)与毛囊干细胞(HFSC)为种子细胞,与壳聚糖-丝素支架共培养形成复合物,移植治疗大鼠皮肤缺损,为组织工程皮肤的临床应用提供实验依据.     

蚕丝-聚乳酸-羟基乙酸共聚物复合编织支架的力学性能及细胞相容性

背景：与通常的合成纤维相比,蚕丝力学性能好,又具有一定的延展性,是制作组织工程韧带/肌腱的良好支架材料,但蚕丝丝素纤维降解速度缓慢,难以与组织再生速率相匹配。 目的：分析蚕丝-聚乳酸-羟基乙酸共聚物编织绳状支架的力学性能及其与骨髓间充质干细胞体外共培养的细胞相容性。 方法：通过捻拧编织蚕丝-聚乳酸-羟基乙酸共聚物细丝混合支架,并以纤维连接蛋白作表面修饰,检测支架的力学性能。将兔骨髓间充质干细胞种植在蚕丝-聚乳酸-羟基乙酸共聚物细丝混合支架上进行体外共培养,观察细胞与支架复合生长、基质形成,以及细胞与支架结合的情况。 结果与结论：蚕丝-聚乳酸-羟基乙酸共聚物混合编织支架呈乳白色,质地均匀,韧性强,为螺旋上升的绳索状,直径为2.3 mm。支架材料的最大负荷、拉伸强度、断点伸长率、弹性模量分别为(315.06±30.77) N、(75.83±7.46) MPa、(61.39±7.26)%、(213.58±23.45) MPa。扫描电镜观察显示,骨髓间充质干细胞贴附于支架表面生长,增殖良好,细胞大多呈梭形,伸出伪足匍匐于材料的表面,形态较佳,伸展良好,呈立体状生长,并分泌基质。表明蚕丝-聚乳酸-羟基乙酸共聚物编织绳状支架具有良好的机械性能及细胞相容性。     

壳聚糖-丝素支架与真皮间充质干细胞的体外复合培养

背景:壳聚糖与丝素有各自的优点和不足,将两者共混,可取长补短,改善性能.进行壳聚糖-丝素支架与真皮间充质干细胞体外复合培养的研究,可进一步为工程化组织构建打下基础.目的:将壳聚糖-丝素支架与大鼠真皮间充质干细胞体外复合培养,探讨壳聚糖-丝素支架对真皮间充质干细胞吸附、生长及增殖的影响.方法:①壳聚糖和丝素以质量比为3:7充分搅拌混匀,冻干制作壳聚糖-丝素海绵状支架,并测其孔径、孔隙率等指标.②将该支架与大鼠真皮间充质干细胞复合进行体外培养,倒置相差显微镜观察细胞与支架复合生长、基质形成以及细胞与支架结合的情况.分别于培养6,12,24 h消化支架上的细胞,计算细胞吸附率.于培养2,4,6,8,10 d后,用MTT法检测细胞增殖率情况.以无支架的细胞培养作为对照组.结果与结论:①倒置相差显微镜及扫描电镜下观察发现该支架有分布较均匀且细密的小孔,孔与孔之间相互连通,孔径大小较均匀,孔径在100～150 μm之间,孔隙率为90.3%.②24 h内,真皮间充质干细胞对支架的黏附率随着时间的增加而逐渐增高,24 h时的黏附率为93%,表明真皮间充质干细胞可良好地黏附于壳聚糖-丝素支架上.③MTT法检测细胞增殖结果显示,于培养各检测时间点,实验组与对照组比较差异均无显著性意义.于培养早期(第2,4天),对照组增殖细胞数略高于实验组;于培养第10天,实验组的增殖细胞数略高于对照组.倒置相差显微镜观察细胞于支架上的形态和附着良好,并有较旺盛的细胞基质分泌.表明真皮间充质干细胞在该支架上能良好地生长、增殖.提示壳聚糖-丝素支架是真皮间充质干细胞体外培养的良好支架材料.