蛋白质糖基化修饰：新一代肝病靶标的分子基础

肝病糖生物学研究是新一代肝病分子诊断标志物及肝癌治疗分子靶点研究的热点领域。不同肝病过程中伴随着复杂的蛋白质N-糖基化和O-糖基化修饰,这些糖基化修饰的变化导致了一些蛋白质翻译后修饰的改变,因而有可能成为未来新的肝病诊断标志物。这些修饰聚糖改变的基础在于肝细胞内部糖基转移酶和糖苷酶活性的变化,因而,对糖基转移酶和糖苷酶活性调控也有可能成为新一代抗癌药物研发的靶点。针对血清蛋白N-糖组分析也已经成为肝癌、肝硬化诊断的新方法。这些进展预示着肝病糖生物学研究将迎来一个新的时代。     

N-糖基化修饰蛋白gp73与肝硬化患者Child-Pugh的关系

目的评价N-糖基化修饰蛋白gp73的血清水平与肝硬化患者Child-Pugh之间的关系及其可能的临床意义。方法所观察的患者均为2009年1月~2010年10月在北京地坛医院门诊及住院肝硬化患者,所有患者均为HBsAg阳性。观察患者共610例,其中男性患者448例,年龄17~82岁,平均48岁;女性患者162例,年龄18~76岁,平均55岁。入组肝硬化患者的Child-Pugh分级主要依据血清白蛋白、总胆红素、凝血酶原活动度、腹水及肝性脑病评价等5项指标。血清gp73浓度采用ELISA法检测。结果伴随肝功能衰退,血清gp73水平也相应升高。血清gp73水平Child-Pugh为C级的患者（255.78 ng/mL±100.89 ng/mL）显著高于B级（203.30 ng/mL±99.15 ng/mL）和A级的患者（125.28 ng/mL±67.05 ng/mL）。血清gp73与白蛋白之间呈显著负相关（r=-0.52,P〈0.0001）。结论 HBV感染肝硬化患者血清gp73水平随肝功能恶化而升高。     

HPLC-MS法同时测定舒血宁注射液中萜类内酯和黄酮醇苷的含量

目的:建立HPLC-MS法同时测定舒血宁注射液中银杏内酯A(GA)、银杏内酯B(GB)、银杏内酯C(GC)、白果内酯(BB)以及槲皮素(QCT)、异鼠李素(ISR)和山柰酚(KAE)的含量。方法:采用Dikma Diamonsil C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5μm),柱温30℃,以乙腈-0.05%甲酸水(v/v)溶液为流动相进行梯度洗脱,流速0.8 mL.min-1,进样量10μL;采用电喷雾离子源进行负离子模式监测,多反应监测模式(MRM)用于定量分析,源喷射电压为-4.5 kV,离子源温度为650℃。7个被测成分的检测离子对分别为m/z 453.1/351.2(GA),m/z 423.1/367.0(GB),m/z 439.0/383.0(GC),m/z 325.0/163.1(BB),m/z301.0/150.9(QCT),m/z 315.1/300.0(ISR),m/z 284.9/93.0(KAE)。结果:在7 min内舒血宁注射液中萜类内酯和黄酮类成分完全分离;峰面积与浓度呈良好的线性关系;加样回收率为97.7%～101.5%,精密度RSD为0.57%～1.20%。结论:建立测定舒血宁注射液中7个成分含量的方法,具有良好的重复性、回收率和精密度,可用于舒血宁注射液的质量控制。     

抗病毒治疗对失代偿期乙肝肝硬化患者预后的影响

目的观察抗病毒治疗对失代偿肝硬化患者生存时间及肝癌发生的影响。方法回顾性分析1998年1月~2009年12月,于北京地坛医院住院至少3次或3次以上的HBV感染相关的失代偿肝硬化患者,抗病毒治疗对其预后的影响。所有分析对象是在最后1次住院期间死亡的患者。其中男168例,女69例。237例患者中70例患者接受了连续6个月以上的抗病毒治疗。耐药检测采用PCR法扩增病毒聚合酶相应的基因片段,并进行测序分析。结果接受核苷类似物抗病毒治疗的70例患者生存时间（34.44±28.39）个月,显著长于未接受治疗的患者（27.12±24.29）个月。167例未接受抗病毒治疗的失代偿肝硬化患者中,最终60例死亡前被确诊为肝癌,发生率为35.93%（60/167）;而接受抗病毒治疗的70例患者中,20例死亡前被确诊为肝癌,肝癌发生率为28.57%（20/70）。两组比较无显著性差异（P=0.37）。治疗期间6例患者出现耐药,但未出现病情加重。结论核苷类似物对HBV感染失代偿肝硬化患者的治疗有助于延长患者的生存期,但不能降低肝癌的发生。     

抑制O-糖基化修饰促进乙型肝炎病毒的释放

目的：探讨抑制O-糖基化修饰对乙型肝炎病毒颗粒组装的影响。方法采用O-糖基化修饰抑制剂Benzyl-α-GalNAc干预HepG2.2.15细胞。经7-AAD染色,应用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。采用实时荧光定量PCR方法检测上清HBV病毒载量。应用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测上清乙型肝炎病毒大蛋白（the hepatitis B virus large surface protein,HBV LHBs）水平。采用蛋白免疫印迹（Western blot）方法检测细胞中LHBs蛋白含量。结果 Benzyl-α-GalNAc能显著促进细胞凋亡,上清中HBV DNA和LHBs水平呈剂量依赖性增加;Benzyl-α-GalNAc抑制细胞中LHBs蛋白表达。结论抑制细胞O-糖基化修饰促进细胞凋亡,从而释放HBV LHBs和病毒颗粒;但在某种程度上抑制细胞O-糖基化修饰能够抑制细胞内LHBs合成。     

FAM172A及其异构体重组蛋白对体外培养肝细胞增殖的影响

目的体外克隆人类基因FAM172A,构建其原核表达载体并诱导其重组蛋白的表达,制备兔抗FAM172A重组蛋白的多克隆抗体,观察其在不同细胞系的表达情况。观察FAM172A-1和FAM172A-3蛋白对L02细胞增殖的影响。方法利用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）及PCR技术,构建原核表达质粒pET-32a（＋）-FAM172A-1和pET-32a（＋）-FAM172A-3。诱导该基因不同异构体重组蛋白的表达,并通过蛋白质免疫印迹（Western blot）技术进行鉴定。纯化后的重组蛋白FAM172A-1和FAM172A-3与肝细胞L02细胞共孵育,观察不同浓度的重组蛋白对细胞增殖的影响。利用纯化后的FAM172A（异构体3）重组蛋白免疫大耳白兔,获得抗FAM172A-3蛋白的多克隆抗体,利用酶联免疫吸附法（ELISA）以及Western blot技术对获得的多克隆抗体进行效价分析及特异性检测。结果成功扩增获得FAM172A（异构体1、3）的基因片段,测序结果与GenBank已公开的基因序列一致;成功表达FAM172A（异构体1、3）的重组蛋白,经过Western blot鉴定正确;纯化后的重组蛋白FAM172A （异构体1、3）与L02细胞共孵育结果发现,两者对L02细胞在一定浓度范围内均有促进细胞增殖的作用。所制备的兔抗人FAM172A-3重组蛋白的多克隆抗体,ELISA检测显示其效价可达1︰1280000, Western blot检测证实该多克隆抗体的特异性良好;Western blot分析显示,该蛋白在肝脏间质细胞和实质细胞均有一定程度的表达。结论 FAM172A蛋白在肝实质细胞及肝间质细胞均表达,且其重组蛋白可以促进L02细胞增殖,推测该基因可能与肝细胞损伤、肝纤维化以及肝细胞再生等发生机制有关。     

隐形矫治器远移成年患者上颌磨牙疗效的Meta分析

目的 评价无托槽隐形矫治器远中移动成年患者上颌磨牙的临床疗效,以提高正畸医生对疗效的预估性。方法 检索Web of Science、The Cochrane Library、Embase、Pubmed、万方数据库、知网数据库、维普数据库公开发表的隐形矫治器远移成年患者上颌磨牙疗效的研究。检索时限为建库以来至2023年8月1日。共3名研究者进行文献筛选及质量评估,将满足质量标准的文献进行Meta分析。结果 本研究共纳入13个前后对照试验,总样本量281例。Meta分析结果显示,治疗后颌骨矢状向及垂直向指标与治疗前相比差异无统计学意义（P>0.05）;治疗后上颌第一磨牙远中移动量MD=-2.34,95%CI(-2.83,-1.85),压低移动量MD=-0.95,95%CI(-1.34,-0.56),远中倾斜量MD=-2.51,95%CI(-3.56,-1.46),与治疗前相比差异均有统计学意义（P<0.05）;治疗后上颌切牙平均内收距离MD=-0.82,95%CI(-1.54,-0.09),唇倾度减小MD=-1.61,95%CI(-2.86,-0.36),与治疗前相比差异均有统...     

功能未知基因C16orf68在不同肝细胞系内的表达特征

目的获取人基因C16orf68,构建原核表达载体,诱导重组蛋白的表达,制备兔抗C16orf68蛋白多克隆抗体,观察C16orf68在各细胞系的表达特征。方法用RT-PCR技术,从肝星状细胞系LX2的总RNA中获得编码C16orf68基因功能片段的cDNA,构建原核表达质粒pET-32a（＋）-C16orf68,并导入大肠埃希菌BL21中,IPTG诱导表达重组的重组蛋白。利用Western blot技术、生物质谱技术对表达的C16orf68进行确认。利用纯化的C16orf68重组蛋白免疫新西兰大白兔,获得抗C16orf68蛋白的多克隆抗体,利用Western blot和酶联免疫吸附法对多克隆抗体进行特异性分析及效价检测。利用Western blot技术观察C16orf68在多个细胞系的表达特征。结果扩增获得C16orf68基因片段,测序结果与GenBank已公开的基因序列相一致,成功表达了C16orf68重组蛋白,经Western blot鉴定、生物质谱Q-TOF分析均显示表达正确。利用纯化后的重组蛋白,制备了兔抗人C16orf68多克隆抗体,酶联免疫吸附法检测证实多克隆抗体效价〉1：320 000,Western blot检测证明多克隆抗体的特异性良好,Western blot结果显示各细胞系该蛋白主要表达于肝实质细胞。结论 C16orf68在肝脏主要表达于肝实质细胞,可能与肝细胞损伤相关。     

糖蛋白C6ORF120在CD4+T淋巴细胞凋亡中的作用研究

背景: 在HIV感染过程中,尽管CD4+T凋亡和CD8+T细胞反应已经进行了广泛的研究,但HIV感染过程中CD4+T细胞凋亡信号究竟是如何启动的,至今尚未被阐述。本研究的目的在于探讨人类功能未知基因C6orf120的功能,阐述其在衣霉素细胞诱导CD4+T细胞凋亡中的可能作用。 方法：从HIV感染者外周血单核细胞（PBMCs）中克隆C6orf120编码序列。将获得的DNA片段插入到pET-32a表达系统中,转化大肠杆菌E.coli,制备C6ORF120重组蛋白。采用磁珠分离法制备原代CD4+T和CD8+T细胞。原代T细胞在1 × 106 细胞/毫升条件下培养,并与0, 0.1, 1, 10, 100, 以及 200 ng/mL 的C6orf120重组蛋白共孵育48小时,然后收获细胞并进行细胞周期和凋亡分析。采用衣霉素诱导Jurkat细胞凋亡。采用内质网应激标志物GRp78和GADD对内质网应激进行评价。 结果: 本研究制备了C6ORF120重组蛋白及其多克隆抗体。免疫组织化学分析显示C6orf120主要表达与肝细胞和淋巴结生发中心的细胞。在0.1, 1, 10, 100, 以及 200 ng/mL浓度下,C6ORF120重组蛋白可以诱导CD4+T细胞凋亡,并增加Jurkat细胞的G2期。Western blot分析显示C6ORF120重组蛋白体外可以增加Jurkat细胞GRp78和GADD的表达。 结论: 研究结果提示,C6ORF120可以诱导CD4+T淋巴细胞的凋亡,其机制至少部分是通过诱导内质网应激实现的。     

蛇床夫内酯在大鼠肝微粒体中的酶促反应动力学研究

 目的 研究蛇床夫内酯在大鼠肝微粒体中的酶促反应动力学。方法 以回芹内酯为内标,采用液质联用（LC/MS）的方法测定蛇床夫内酯在体外代谢中的代谢产物3″,8- 甲氧基异欧前胡内酯（M1）和5″- 羟基-8- 甲氧基异欧前胡内酯（M2）。用Linewrave-Burk作图分析数据,计算酶促动力学常数。结果 代谢物M1的V_max=1.152 5 μmol·(min·mg pro)-1, K_m=133.156 6 μmol·L-1,M2的V_max=1.630 8 μmol·(min·mg pro)-1, K_m=292.857 1 μmol·L-1。 结论 该方法简单、快速、可靠,适用于蛇床夫内酯的体外代谢研究。