C2C12细胞体外微型灌注生物反应器培养初探

目的 研究组织工程种子细胞C2C12在微型灌注生物反应器中培养的特点,以期探索一种有效的种子细胞体外培养方法.方法 在自行研制的微型灌注生物反应器中以20%换液量/天、30%换液量/天两种条件进行C2C12细胞培养,通过细胞形态、生长曲线、细胞群体倍增时间及生化代谢离线检测等对培养情况进行研究.结果 微型灌注生物反应器培养较传统的细胞培养瓶培养,培养基使用效率提高;在细胞形态无显著性变化的情况下,细胞群体倍增时间显著缩短.而且,C2C12细胞的生化代谢在20%换液量/天灌注条件下较30%换液量/天的为佳.结论 C2C12细胞的灌注生物反应器培养方式较传统的细胞培养瓶培养方式优越,同时,20%换液量/天的灌注条件较30%换液量/天为佳.该灌注培养体系值得进一步深入研究.     

人脐带间充质干细胞不同移植途径对大鼠糖尿病足愈合影响的研究

目的 探讨人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)不同移植方式对大鼠糖尿病足(DF)的影响。方法 37只Wistar雄性大鼠随机分为实验组(n=32)和对照组(Con,n=5)。实验组高脂饲料喂养两个月后造模成功,腹腔注射STZ 30mg/kg,重复2~3次直至出现高血糖,Con组注射等体积、等次数的缓冲液。造模成功后将造模组(Mod)随机分为模型组(DM)、局部低剂量组(LD,0.5×106/0.2ml)、局部高剂量组(HD,1.0×106/0.2ml)和静脉组(VI,2.0×106/0.2 ml),每组各5只。各组足背部切除1块约3mm×7mm矩形全层皮肤组织,第2天按分组移植干细胞,比较各组溃疡愈合时间和溃疡面积。结果 hUC-MSCs表面标记为CD 29、CD 44、CD 90和CD l105高表达;20只大鼠造模成功,STZ注射后14d血糖为(21.54±2.71)mmol/L,伴多饮、多尿、消瘦等症状,注射后7d体重低于Con组[(519.08±68.79)vs(577.50±47.86)g,P0.05]。细胞移植8d后比较各组间皮肤溃疡面积,结果显示,与细胞移植时的溃疡面积比较,DM组溃疡面积为33.1%,HD组、VI组及Con组皮肤溃疡面积分别为26.6%、23.0%和21%,溃疡面积缩小(P0.05);LD组溃疡面积为33.5%;伤口痊愈时检测血清中VEGF,结果显示,与DM组[(25.17±9.88)pg/ml]比较,Con组[(83.12±19.13)pg/ml]及LD组[(75.15±37.59)pg/ml]含量差异有统计学意义(P0.01);与DM组比较,VI组TG、TC降低,C-P水平升高。结论 两种hUC-MSCs移植方法在促进糖尿病伤口愈合方面机制不同,静脉移植有利于改善糖尿病整体代谢情况。     

生理性低氧条件下脐带和经血来源间充质干细胞的生物学特性

背景:间充质干细胞具有治疗糖尿病、移植物抗宿主病、卵巢早衰等多种疾病的潜能,但是传统培养方法存在着细胞增长缓慢、容易衰老等问题.生理性低氧有望改善间充质干细胞的生物学性能,因而有可能作为优化的培养方法.目的:探究生理性低氧对脐带间充质干细胞和经血源性间充质干细胞生物学特性的影响.方法:将脐带间充质干细胞和经血源性间充质...     

循环灌注接种方法在人脐带间充质干细胞骨组织工程中的应用

背景:课题前期设计了一套模块式三维灌注生物反应器系统,并初步将其应用于大鼠骨髓间充质干细胞接种于三维非纺型聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate,PET)纤维片状载体的骨组织工程研究中。目的:应用自制的循环灌注接种系统将传代人脐带间充质干细胞接种至三维无纺布PET片状载体,并与传统的静态接种方法接种的载体进行比较。方法:培养传代人脐带间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面标记,将细胞用循环灌注方法(高速率组和低速率组)和静态接种方法接种至三维聚PET无纺布片状载体。结果与结论:传代细胞形态稳定、活力好,高标达CD90,CD105,不表达CD14,CD45。循环灌注方法组的接种效率,细胞密度,增殖能力均优于静态接种组。循环灌注高速率组乳酸脱氢酶偏高,并且细胞的延迟期长于静态接种。循环灌注组的碱性磷酸酶活性高于静态接种组。结果表明,循环灌注接种方法更适合间充质干细胞骨组织工程的应用,进一步应用仍需对工程参数进行优化。     

人脐带间充质干细胞半连续灌注培养：灌注启动时间及灌注频率和灌注体积

背景：人脐带间充质干细胞作为新的种子细胞来源,如何迅速提高其增殖以满足临床所需的数量和质量,是迫切需要解决的现实问题。目的：探讨不同的灌注启动时间、灌注频率和灌注体积对人脐带间充质干细胞扩增和代谢的影响,建立高密度培养的半连续灌注培养工艺。方法：培养传代人脐带间充质干细胞,以批培养方式为参照,半连续灌注培养分成3组。①灌注启动时间组：批培养24h和48h,分别开始换液,每2d更换75％。②灌注频率组：批培养48h开始换液,频率分别为每1,2,3d,换液体积比为75％。⑧灌注体积组：批培养48h开始换液,频率为每2d,换液体积比分别为25％,50％,75％,100％。结果与结论：相对于其他培养条件,灌注启动时间为48h、频率为每天、体积比为75％的静态培养条件下,稀释率较大,细胞密度较大,葡萄糖比消耗速率和乳酸比生成速率较高,谷氨酰胺比消耗速率较低,氨比生成速率较高,乳酸对葡萄糖的代谢系数较低,谷氨酰胺的代谢系数较高。这表明稀释率大,不仅葡萄糖和谷氨酰胺充足,而且细胞所需的微量元素和未知的因子也充足,满足了细胞生长的要求;同时排除乳酸和氨等对细胞的影响,去除条件培养基中某些因子对细胞的交互影响,提高了细胞的增殖。     

循环灌注接种方法在人脐带间充质干细胞骨组织工程中的应用

背景：课题前期设计了一套模块式三维灌注生物反应器系统,并初步将其应用于大鼠骨髓间充质干细胞接种于三维非纺型聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate,PET)纤维片状载体的骨组织工程研究中。 目的：应用自制的循环灌注接种系统将传代人脐带间充质干细胞接种至三维无纺布PET片状载体,并与传统的静态接种方法接种的载体进行比较。 方法：培养传代人脐带间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面标记,将细胞用循环灌注方法(高速率组和低速率组)和静态接种方法接种至三维聚PET无纺布片状载体。 结果与结论：传代细胞形态稳定、活力好,高标达 CD90,CD105,不表达CD14,CD45。循环灌注方法组的接种效率,细胞密度,增殖能力均优于静态接种组。循环灌注高速率组乳酸脱氢酶偏高,并且细胞的延迟期长于静态接种。循环灌注组的碱性磷酸酶活性高于静态接种组。结果表明,循环灌注接种方法更适合间充质干细胞骨组织工程的应用,进一步应用仍需对工程参数进行优化。     

葡萄糖和谷氨酰胺浓度对人脐带间充质干细胞体外培养的影响

目的探索葡萄糖和谷氨酰胺浓度对人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)体外培养的影响。方法分离、培养hUC-MSCs,光学显微镜观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞表面抗原。采用不同浓度葡萄糖和谷氨酰胺对hUC-MSCs进行体外培养,结晶紫计数法记录细胞增殖曲线,并检测培养液中营养物质及其代谢产物。结果传代的hUC-MSCs均一地高表达CD29、CD44、CD105和CD90,不表达CD14、CD45。葡萄糖浓度增加,会促进细胞的增殖,对葡萄糖消耗、乳酸生成和谷氨酰胺消耗没有影响,但增加了氨的生成;谷氨酰胺浓度增加,对细胞增殖的促进作用有限,但可提高细胞的生长速率,从而缩短培养时间,对葡萄糖和谷氨酰胺的消耗影响不大,但增加了乳酸和氨的生成。结论葡萄糖和谷氨酰胺都可促进细胞的增殖。葡萄糖缺失时其他氨基酸充当氮源,谷氨酰胺充足时谷氨酰胺转化成乳酸的通量增大。     

骨组织工程用三维灌注生物反应器系统的设计

目的:设计并构建一套骨组织工程用三维灌注生物反应器系统。方法:①明确骨组织工程用生物反应器系统的设计原则。②灌注小室由管状玻璃主体、聚四氟乙烯螺帽以及橡胶O型圈构建组成。整个系统通过铂处理的硅胶管以及三通和四通将3个灌注小室、双向蠕动泵、培养液贮存瓶、废液贮存瓶、接种口和空气滤膜连接构成。③研究生物反应器系统操作程序。④计算细胞/支架结构体内细胞受到的流体剪切力。结果:设计并构建了一套三维灌注生物反应器系统,既可以减轻内外扩散限制,也可以将力学刺激作用于细胞。该系统区别于其他设计的主要特点是:将细胞接种和长期培养整合于一体构建工程化组织;培养基可以完全穿过支架内部;同时,其模块式设计不仅可以增加工程化组织培养的数量,而且可以根据实验目的在不同时间点灵活方便地收获结构体。结构体内细胞所受到的流体剪切力可以根据灌注速率和支架性质进行计算。结论:所设计的三维灌注生物反应器系统在骨组织工程中具有广阔的应用前景,不仅可以构建工程化骨组织用于临床修复骨缺损,而且可以用于研究流体剪切力作用对骨细胞在三维支架中行为的影响。